高通量測序得到的突變位點必須經(jīng)過驗證
高通量測序可以從數(shù)百萬個堿基中標(biāo)記出一個突變，但按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范，所有報告的突變必須經(jīng)過一代測序驗證。
一、技術(shù)盲區(qū)
NGS的強大毋庸置疑，但它并非完美無缺。這項技術(shù)本質(zhì)上是將基因組打碎成片段進(jìn)行測序，然后通過計算重新組裝。在這個過程中，某些基因組區(qū)域會成為技術(shù)的“盲區(qū)”。
重復(fù)區(qū)域是最典型的問題。基因序列中可能連續(xù)出現(xiàn)7、8個相同的堿基（如AAAAAAA），當(dāng)NGS的短讀長跨越這些區(qū)域時，準(zhǔn)確判斷重復(fù)次數(shù)變得異常困難。
高GC含量區(qū)域是另一個挑戰(zhàn)。GC堿基對結(jié)合更加緊密，使得這些區(qū)域在測序文庫制備中難以處理，常常導(dǎo)致覆蓋不足或完全缺失。
同源序列則難以區(qū)分。短讀長無法跨越高度同源區(qū)域，難以找到唯一比對位置，算法可能比對到序列的錯誤位置，產(chǎn)生誤導(dǎo)性結(jié)果。
染色體結(jié)構(gòu)變異同樣棘手，當(dāng)遇到大片段的插入、缺失、倒位或重復(fù)時，NGS很難精確定位變異的起點和終點。
這些技術(shù)局限性不是理論上的擔(dān)憂。而2019年《Journal of Molecular Diagnostics》的一項調(diào)查發(fā)現(xiàn)，一些實驗室的NGS檢測結(jié)果，超過2%（特別是插入/缺失）是錯誤的，這樣的錯誤集中出現(xiàn)在上述的技術(shù)盲區(qū)。
二、驗證金標(biāo)準(zhǔn)
當(dāng)NGS標(biāo)記出一個陽性突變時，尤其是位于上述高風(fēng)險區(qū)域的突變，一代測序仍然是無可爭議的“金標(biāo)準(zhǔn)”。與NGS的間接推斷不同，Sanger測序產(chǎn)生的是直觀、連續(xù)的序列數(shù)據(jù)，以清晰的峰圖形式呈現(xiàn)。
驗證的必要性已經(jīng)滲透到行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和指南中。美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會在其技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)中明確指出：“對于用于臨床診斷的NGS檢測，應(yīng)使用正交方法驗證所有致病和可能致病變異。”
歐洲分子基因診斷質(zhì)量聯(lián)盟的指南則更加具體：“對于NGS檢測到的序列變異，特別是位于復(fù)雜基因組區(qū)域的變異，應(yīng)使用Sanger測序進(jìn)行確認(rèn)。”
三、系統(tǒng)性驗證
在實驗設(shè)計階段，前瞻性規(guī)劃驗證策略。這包括在樣本預(yù)算中預(yù)留驗證專用材料，專門的經(jīng)費和實驗時間。
在數(shù)據(jù)分析階段，實施風(fēng)險分層評估。不是所有變異都需要同等級別的驗證。可以根據(jù)變異類型、基因組位置和臨床重要性建立分層驗證方案：位于高風(fēng)險復(fù)雜區(qū)域的陽性突變需要驗證；新發(fā)現(xiàn)的且預(yù)測為目標(biāo)的突變需要驗證；用于指導(dǎo)關(guān)鍵治療決策的變異必須驗證。
對于臨床實驗室，還有額外的質(zhì)量控制要求。許多認(rèn)證機構(gòu)要求實驗室定期進(jìn)行陽性樣本的再驗證，確保整個檢測流程的持續(xù)準(zhǔn)確性。人員培訓(xùn)也至關(guān)重要——技術(shù)人員必須能夠正確解讀Sanger測序峰圖，識別可能的偽影。
四、成本與風(fēng)險的權(quán)衡
Sanger測序每個反應(yīng)需要額外的經(jīng)費，驗證流程可能使報告延遲幾天到一周。但比起錯誤診斷帶來的代價，這些成本微不足道。
一次假陽性報告可能導(dǎo)致不必要的治療，甚至手術(shù)。而一次假陰性則可能讓患者錯過早期干預(yù)的機會。
對于研究項目，未經(jīng)驗證的陽性結(jié)果可能導(dǎo)致整個研究方向的錯誤，浪費數(shù)月甚至數(shù)年的工作時間。在論文評審過程中，審稿人通常也會提出這方面的要求。
一、技術(shù)盲區(qū)
NGS的強大毋庸置疑，但它并非完美無缺。這項技術(shù)本質(zhì)上是將基因組打碎成片段進(jìn)行測序，然后通過計算重新組裝。在這個過程中，某些基因組區(qū)域會成為技術(shù)的“盲區(qū)”。
重復(fù)區(qū)域是最典型的問題。基因序列中可能連續(xù)出現(xiàn)7、8個相同的堿基（如AAAAAAA），當(dāng)NGS的短讀長跨越這些區(qū)域時，準(zhǔn)確判斷重復(fù)次數(shù)變得異常困難。
高GC含量區(qū)域是另一個挑戰(zhàn)。GC堿基對結(jié)合更加緊密，使得這些區(qū)域在測序文庫制備中難以處理，常常導(dǎo)致覆蓋不足或完全缺失。
同源序列則難以區(qū)分。短讀長無法跨越高度同源區(qū)域，難以找到唯一比對位置，算法可能比對到序列的錯誤位置，產(chǎn)生誤導(dǎo)性結(jié)果。
染色體結(jié)構(gòu)變異同樣棘手，當(dāng)遇到大片段的插入、缺失、倒位或重復(fù)時，NGS很難精確定位變異的起點和終點。
這些技術(shù)局限性不是理論上的擔(dān)憂。而2019年《Journal of Molecular Diagnostics》的一項調(diào)查發(fā)現(xiàn)，一些實驗室的NGS檢測結(jié)果，超過2%（特別是插入/缺失）是錯誤的，這樣的錯誤集中出現(xiàn)在上述的技術(shù)盲區(qū)。
二、驗證金標(biāo)準(zhǔn)
當(dāng)NGS標(biāo)記出一個陽性突變時，尤其是位于上述高風(fēng)險區(qū)域的突變，一代測序仍然是無可爭議的“金標(biāo)準(zhǔn)”。與NGS的間接推斷不同，Sanger測序產(chǎn)生的是直觀、連續(xù)的序列數(shù)據(jù)，以清晰的峰圖形式呈現(xiàn)。
驗證的必要性已經(jīng)滲透到行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和指南中。美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會在其技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)中明確指出：“對于用于臨床診斷的NGS檢測，應(yīng)使用正交方法驗證所有致病和可能致病變異。”
歐洲分子基因診斷質(zhì)量聯(lián)盟的指南則更加具體：“對于NGS檢測到的序列變異，特別是位于復(fù)雜基因組區(qū)域的變異，應(yīng)使用Sanger測序進(jìn)行確認(rèn)。”
三、系統(tǒng)性驗證
在實驗設(shè)計階段，前瞻性規(guī)劃驗證策略。這包括在樣本預(yù)算中預(yù)留驗證專用材料，專門的經(jīng)費和實驗時間。
在數(shù)據(jù)分析階段，實施風(fēng)險分層評估。不是所有變異都需要同等級別的驗證。可以根據(jù)變異類型、基因組位置和臨床重要性建立分層驗證方案：位于高風(fēng)險復(fù)雜區(qū)域的陽性突變需要驗證；新發(fā)現(xiàn)的且預(yù)測為目標(biāo)的突變需要驗證；用于指導(dǎo)關(guān)鍵治療決策的變異必須驗證。
對于臨床實驗室，還有額外的質(zhì)量控制要求。許多認(rèn)證機構(gòu)要求實驗室定期進(jìn)行陽性樣本的再驗證，確保整個檢測流程的持續(xù)準(zhǔn)確性。人員培訓(xùn)也至關(guān)重要——技術(shù)人員必須能夠正確解讀Sanger測序峰圖，識別可能的偽影。
四、成本與風(fēng)險的權(quán)衡
Sanger測序每個反應(yīng)需要額外的經(jīng)費，驗證流程可能使報告延遲幾天到一周。但比起錯誤診斷帶來的代價，這些成本微不足道。
一次假陽性報告可能導(dǎo)致不必要的治療，甚至手術(shù)。而一次假陰性則可能讓患者錯過早期干預(yù)的機會。
對于研究項目，未經(jīng)驗證的陽性結(jié)果可能導(dǎo)致整個研究方向的錯誤，浪費數(shù)月甚至數(shù)年的工作時間。在論文評審過程中，審稿人通常也會提出這方面的要求。
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