Bulk RNA-seq與單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序整合應(yīng)用的方案設(shè)計及案例分享
Bulk RNA-seq與單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序（scRNA-seq）的整合應(yīng)用，已成為當(dāng)前生命科學(xué)領(lǐng)域解析復(fù)雜生物學(xué)問題的核心研究策略。Bulk RNA-seq聚焦組織或細(xì)胞群體的整體表達(dá)水平，具備測序深度深、基因覆蓋度廣、數(shù)據(jù)穩(wěn)定性高的優(yōu)勢，可高效獲取樣本全局轉(zhuǎn)錄組特征；scRNA-seq則突破群體平均表達(dá)的局限，以單細(xì)胞分辨率精準(zhǔn)解析細(xì)胞異質(zhì)性，清晰界定不同細(xì)胞亞群的轉(zhuǎn)錄組差異及功能特性。二者的協(xié)同聯(lián)用可實現(xiàn)技術(shù)優(yōu)勢互補：Bulk RNA-seq為研究提供宏觀轉(zhuǎn)錄組背景框架與核心表達(dá)趨勢，scRNA-seq則完成目標(biāo)基因或通路的細(xì)胞類型級精準(zhǔn)定位，不僅能通過交叉驗證提升實驗結(jié)果的可靠性與重復(fù)性，更可從“群體-單細(xì)胞”雙維度層層遞進(jìn)，深化對生物學(xué)過程調(diào)控機制的系統(tǒng)認(rèn)知，為后續(xù)功能驗證及轉(zhuǎn)化研究筑牢數(shù)據(jù)根基。
一、基于scRNA-seq挖掘的細(xì)胞類型特異性表達(dá)模式，通過Bulk RNA-seq進(jìn)行群體水平驗證
scRNA-seq實驗設(shè)計：嚴(yán)格設(shè)置3個及以上生物學(xué)重復(fù)，規(guī)避個體差異及技術(shù)偏差對細(xì)胞亞群注釋、特異性基因篩選的干擾，精準(zhǔn)識別不同細(xì)胞類型的特征性表達(dá)譜及核心調(diào)控基因。
Bulk RNA-seq實驗設(shè)計：選取與scRNA-seq來源一致的組織樣本或細(xì)胞群體，保持實驗分組、處理條件的一致性，同步設(shè)置3個及以上生物學(xué)重復(fù)，通過群體水平測序驗證scRNA-seq所獲細(xì)胞類型特異性基因的表達(dá)趨勢，強化結(jié)果的統(tǒng)計學(xué)意義與普適性。
scRNA-seq實驗設(shè)計：設(shè)置3個及以上生物學(xué)重復(fù)，確保細(xì)胞亞群分群的準(zhǔn)確性與穩(wěn)定性，為差異基因的細(xì)胞定位提供高分辨率數(shù)據(jù)支撐。
Bulk RNA-seq實驗設(shè)計：可先通過流式細(xì)胞術(shù)分選目標(biāo)細(xì)胞亞群，或直接采用全組織樣本進(jìn)行測序，篩選不同處理組間的差異表達(dá)基因（DEGs）；實驗需設(shè)置3個及以上生物學(xué)重復(fù)，保障差異基因篩選的可靠性，為后續(xù)scRNA-seq精準(zhǔn)定位其表達(dá)的細(xì)胞亞群提供明確靶向。
💯核心分析
💯文獻(xiàn)案例
一：ATM缺失誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞激活促進(jìn)共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴張癥的神經(jīng)退行性病變
A-T患者iPSC衍生的小膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)元共培養(yǎng)中表現(xiàn)出細(xì)胞內(nèi)激活和細(xì)胞毒性增強
標(biāo)題：ATM-deficiency-induced microglial activation promotes neurodegeneration in ataxia-telangiectasia
期刊：Cell Reports
影響因子：6.9
研究背景：
共濟(jì)失調(diào)-毛細(xì)血管擴張癥（ataxia-telangiectasia, A-T）是一種由ATM基因突變所致的罕見遺傳性疾病，其核心病理特征為選擇性小腦神經(jīng)元進(jìn)行性退化，臨床表現(xiàn)復(fù)雜且預(yù)后較差，目前其潛在發(fā)病機制尚未完全闡明。ATM蛋白作為多功能調(diào)控分子，除核心介導(dǎo)DNA損傷應(yīng)答通路外，還廣泛參與細(xì)胞代謝穩(wěn)態(tài)調(diào)控、溶酶體功能維持等多種生理過程。值得注意的是，ATM缺失小鼠模型難以復(fù)現(xiàn)人類A-T特有的小腦退化表型，而人類細(xì)胞層面的研究提示，鈣信號通路（如ITPR1介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)）紊亂、突觸功能異常及氧化應(yīng)激失衡等可能參與疾病發(fā)生。近年來，新興研究證據(jù)表明小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬功能障礙或與A-T病理進(jìn)程密切相關(guān)，但其在ATM缺失介導(dǎo)的神經(jīng)退行性病變中的具體作用機制及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，仍是當(dāng)前領(lǐng)域亟待明確的關(guān)鍵科學(xué)問題，也為該研究的開展提供了核心切入點。
研究思路：
研究結(jié)果：
本研究創(chuàng)新性整合單核RNA測序（snRNA-seq）與Bulk轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù)，系統(tǒng)解析了ATM缺陷介導(dǎo)共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴張癥（A-T）小腦退化的細(xì)胞特異性機制。此前基于Bulk轉(zhuǎn)錄組的研究雖已揭示A-T患者腦組織整體基因表達(dá)譜的紊亂特征，但受限于群體平均表達(dá)水平的檢測模式，無法精準(zhǔn)區(qū)分不同細(xì)胞類型的特異性轉(zhuǎn)錄組變化，難以闡明病變的細(xì)胞起源。為此，本研究通過snRNA-seq技術(shù)構(gòu)建了人類小腦及前額葉皮層的高分辨率單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜，成功注釋出浦肯野細(xì)胞、顆粒細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞等中樞神經(jīng)系統(tǒng)核心細(xì)胞類型。
A-T患者iPSC衍生的小膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)元共培養(yǎng)中表現(xiàn)出細(xì)胞內(nèi)激活和細(xì)胞毒性增強二：E3 泛素連接酶 Rbx1 介導(dǎo)胸腺發(fā)育調(diào)控及 αβ/γδ T 細(xì)胞命運抉擇
標(biāo)題：E3 Ligase Rbx1 Orchestrates Thymus Development and Fate Determination of αβ-γδ T Cells
期刊：Research
標(biāo)題：E3 Ligase Rbx1 Orchestrates Thymus Development and Fate Determination of αβ-γδ T Cells
期刊：Research
影響因子：16.6
研究背景：
胸腺是 T 細(xì)胞分化的核心場所，骨髓來源的前體細(xì)胞在此分化為 αβ 與 γδ 兩大亞型，DN3 階段為二者的命運分叉關(guān)鍵節(jié)點：αβ T 細(xì)胞進(jìn)一步發(fā)育為 CD4⁺/CD8⁺亞群，參與機體適應(yīng)性免疫應(yīng)答；γδ T 細(xì)胞則作為先天免疫效應(yīng)細(xì)胞，可分化為 IFN-γ⁺（γδ T1）或 IL-17⁺（γδ T17）亞群，在抗感染與抗腫瘤中發(fā)揮重要作用。目前，調(diào)控 αβ/γδ T 細(xì)胞分化的分子機制仍未闡明。Neddylation-CRL 系統(tǒng)是最大的 E3 泛素連接酶家族，其通過 Rbx1/Sag 等 E3 酶及 Ube2m/Ube2f 等 E2 酶介導(dǎo)底物泛素化降解，雖已被證實參與 Treg、樹突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞的功能調(diào)控，但其在胸腺發(fā)育及 αβ/γδ T 細(xì)胞命運決定中的作用，至今仍是研究空白。
研究思路：
研究結(jié)果：
本研究構(gòu)建胸腺特異性敲除 Ube2m、Ube2f、Rbx1 或 Sag 的條件性基因敲除小鼠模型，結(jié)果證實僅 Rbx1 對胸腺發(fā)育及 αβ/γδ T 細(xì)胞命運決定具有關(guān)鍵調(diào)控作用。Rbx1 缺失可引發(fā)胸腺萎縮、T 細(xì)胞發(fā)育阻滯，伴隨胸腺內(nèi) γδ T 細(xì)胞占比顯著升高、未成熟 Gzma⁺ γδ T 細(xì)胞比例擴增，且增殖亞群占比降低；上述部分表型可通過共敲除 Bim 實現(xiàn)部分逆轉(zhuǎn)。機制研究表明，Rbx1 缺失會重塑祖 γδ T 細(xì)胞 / DN3a 細(xì)胞中 Akt、NF-κB 及代謝通路的活性；最終，Rbx1 缺失可顯著改變胸腺內(nèi) γδ T1/T17 細(xì)胞亞群的構(gòu)成，明確揭示 Rbx1 對 γδ T 細(xì)胞命運決定的調(diào)控功能。
Rbx1對DN3和DN4細(xì)胞功能的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序研究
胸腺中Rbx1缺陷型DN3a細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄分析
三：衰老免疫細(xì)胞釋放顆粒鈣素促進(jìn)骨骼衰老
標(biāo)題：Senescent immune cells release grancalcin to promote skeletal aging
期刊：Cell Metabolism
期刊：Cell Metabolism
影響因子：30.9
研究背景：
骨髓微環(huán)境通過提供信號支持并調(diào)控各類骨相關(guān)細(xì)胞功能，維持骨穩(wěn)態(tài)平衡。骨穩(wěn)態(tài)的維持依賴骨髓內(nèi)細(xì)胞活動的協(xié)同調(diào)控，其中成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成是核心環(huán)節(jié)之一。然而，衰老過程中骨穩(wěn)態(tài)常被打破，表現(xiàn)為骨轉(zhuǎn)換水平降低、骨髓脂肪異常積聚，最終誘發(fā)骨質(zhì)疏松及脆性骨折，其潛在機制尚未完全闡明。已有研究證實，免疫細(xì)胞隨衰老在骨髓中富集，可能通過分泌特異性因子參與骨衰老進(jìn)程；顆粒鈣素（GCA）作為五 EF 手鈣結(jié)合蛋白家族成員，雖已知參與免疫調(diào)節(jié)，但在骨衰老中的具體功能及調(diào)控通路仍不明確�；诖耍狙芯恐荚谙到y(tǒng)探究 GCA 作為衰老免疫細(xì)胞分泌因子，通過受體 PLXNB2 介導(dǎo)的信號通路抑制骨形成、促進(jìn)脂肪生成的分子機制，為揭示骨衰老新機制及開發(fā)針對性干預(yù)策略提供潛在靶點。
研究思路：
研究結(jié)果：
本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠與小鼠衰老進(jìn)程中，促炎及衰老表型的免疫細(xì)胞亞型（含巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞）在骨髓中富集，并大量分泌顆粒鈣素（GCA）。向幼鼠注射重組 GCA（rGCA）可直接誘導(dǎo)骨骼早衰；反之，特異性敲除中性粒細(xì)胞與巨噬細(xì)胞中的 GCA 基因，能顯著延緩骨骼衰老進(jìn)程。機制層面，GCA 可與 plexin-B2 受體結(jié)合，通過部分抑制其下游信號通路，調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞功能，最終抑制成骨分化、促進(jìn)脂肪生成。進(jìn)一步研究顯示，骨骼干細(xì)胞中 Plexnb2 雜合子缺失，可顯著改善 GCA 基因敲除小鼠的骨表型。此外，作者研發(fā)的 GCA 中和抗體，對老年小鼠進(jìn)行治療后可有效改善其骨骼健康。綜上，本研究證實 GCA 是調(diào)控骨骼衰老的關(guān)鍵因子，有望成為老年性骨質(zhì)疏松癥的潛在治療靶點。
促炎和衰老免疫細(xì)胞在骨髓中積累，并在衰老過程中分泌豐富的GCA
GCA抑制成骨和破骨細(xì)胞生成，同時促進(jìn)脂肪生成
💯總結(jié)：
scRNA-seq 與 Bulk RNA-seq 的整合分析，突破了單一測序技術(shù)的局限 —— 以 Bulk RNA-seq 構(gòu)建的宏觀表達(dá)背景為基礎(chǔ)，結(jié)合 scRNA-seq 解析的細(xì)胞類型特異性及異質(zhì)性信息，形成 “宏觀 - 微觀” 相互驗證、補充的分析體系，既提升了研究結(jié)論的穩(wěn)健性，又推動生物學(xué)機制研究從群體平均表型深入至單細(xì)胞異質(zhì)性層面。目前，該策略已廣泛應(yīng)用于復(fù)雜生物學(xué)過程解析、疾病發(fā)生發(fā)展機制探索等領(lǐng)域，成為不可或缺的核心研究工具。展望未來，隨著空間轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組、代謝組等多組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，將其與 scRNA-seq/Bulk RNA-seq 整合策略相結(jié)合，有望進(jìn)一步揭示細(xì)胞功能的時空動態(tài)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，實現(xiàn)對生命活動本質(zhì)更系統(tǒng)、深入的認(rèn)知。
💯scRNA-seq 與 Bulk RNA-seq測序哪個公司提供：
樂備實提供單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序（點擊）和Bulk RNA-seq測序（點擊）。
樂備實（上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司旗下全資子公司），是國內(nèi)專注于提供高質(zhì)量蛋白檢測以及組學(xué)分析服務(wù)的實驗服務(wù)專家，自2018年成立以來，樂備實不斷尋求突破，公司的服務(wù)技術(shù)平臺已擴展到單細(xì)胞測序、空間多組學(xué)、流式檢測、超敏電化學(xué)發(fā)光、Luminex多因子檢測、抗體芯片、PCR Array、ELISA、Elispot、PLA蛋白互作、多色免疫組化、DSP空間多組學(xué)等30多個，建立起了一套涵蓋基因、蛋白、細(xì)胞以及組織水平實驗的完整檢測體系。
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