高通量測(cè)序得到的突變位點(diǎn)必須經(jīng)過驗(yàn)證
高通量測(cè)序可以從數(shù)百萬個(gè)堿基中標(biāo)記出一個(gè)突變，但按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范，所有報(bào)告的突變必須經(jīng)過一代測(cè)序驗(yàn)證。
一、技術(shù)盲區(qū)
NGS的強(qiáng)大毋庸置疑，但它并非完美無缺。這項(xiàng)技術(shù)本質(zhì)上是將基因組打碎成片段進(jìn)行測(cè)序，然后通過計(jì)算重新組裝。在這個(gè)過程中，某些基因組區(qū)域會(huì)成為技術(shù)的“盲區(qū)”。
重復(fù)區(qū)域是最典型的問題�；蛐蛄兄锌赡苓B續(xù)出現(xiàn)7、8個(gè)相同的堿基（如AAAAAAA），當(dāng)NGS的短讀長(zhǎng)跨越這些區(qū)域時(shí)，準(zhǔn)確判斷重復(fù)次數(shù)變得異常困難。
高GC含量區(qū)域是另一個(gè)挑戰(zhàn)。GC堿基對(duì)結(jié)合更加緊密，使得這些區(qū)域在測(cè)序文庫制備中難以處理，常常導(dǎo)致覆蓋不足或完全缺失。
同源序列則難以區(qū)分。短讀長(zhǎng)無法跨越高度同源區(qū)域，難以找到唯一比對(duì)位置，算法可能比對(duì)到序列的錯(cuò)誤位置，產(chǎn)生誤導(dǎo)性結(jié)果。
染色體結(jié)構(gòu)變異同樣棘手，當(dāng)遇到大片段的插入、缺失、倒位或重復(fù)時(shí)，NGS很難精確定位變異的起點(diǎn)和終點(diǎn)。
這些技術(shù)局限性不是理論上的擔(dān)憂。而2019年《Journal of Molecular Diagnostics》的一項(xiàng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，一些實(shí)驗(yàn)室的NGS檢測(cè)結(jié)果，超過2%（特別是插入/缺失）是錯(cuò)誤的，這樣的錯(cuò)誤集中出現(xiàn)在上述的技術(shù)盲區(qū)。
二、驗(yàn)證金標(biāo)準(zhǔn)
當(dāng)NGS標(biāo)記出一個(gè)陽性突變時(shí)，尤其是位于上述高風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域的突變，一代測(cè)序仍然是無可爭(zhēng)議的“金標(biāo)準(zhǔn)”。與NGS的間接推斷不同，Sanger測(cè)序產(chǎn)生的是直觀、連續(xù)的序列數(shù)據(jù)，以清晰的峰圖形式呈現(xiàn)。
驗(yàn)證的必要性已經(jīng)滲透到行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和指南中。美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)在其技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)中明確指出：“對(duì)于用于臨床診斷的NGS檢測(cè)，應(yīng)使用正交方法驗(yàn)證所有致病和可能致病變異。”
歐洲分子基因診斷質(zhì)量聯(lián)盟的指南則更加具體：“對(duì)于NGS檢測(cè)到的序列變異，特別是位于復(fù)雜基因組區(qū)域的變異，應(yīng)使用Sanger測(cè)序進(jìn)行確認(rèn)。”
三、系統(tǒng)性驗(yàn)證
在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)階段，前瞻性規(guī)劃驗(yàn)證策略。這包括在樣本預(yù)算中預(yù)留驗(yàn)證專用材料，專門的經(jīng)費(fèi)和實(shí)驗(yàn)時(shí)間。
在數(shù)據(jù)分析階段，實(shí)施風(fēng)險(xiǎn)分層評(píng)估。不是所有變異都需要同等級(jí)別的驗(yàn)證�？梢愿鶕�(jù)變異類型、基因組位置和臨床重要性建立分層驗(yàn)證方案：位于高風(fēng)險(xiǎn)復(fù)雜區(qū)域的陽性突變需要驗(yàn)證；新發(fā)現(xiàn)的且預(yù)測(cè)為目標(biāo)的突變需要驗(yàn)證；用于指導(dǎo)關(guān)鍵治療決策的變異必須驗(yàn)證。
對(duì)于臨床實(shí)驗(yàn)室，還有額外的質(zhì)量控制要求。許多認(rèn)證機(jī)構(gòu)要求實(shí)驗(yàn)室定期進(jìn)行陽性樣本的再驗(yàn)證，確保整個(gè)檢測(cè)流程的持續(xù)準(zhǔn)確性。人員培訓(xùn)也至關(guān)重要——技術(shù)人員必須能夠正確解讀Sanger測(cè)序峰圖，識(shí)別可能的偽影。
四、成本與風(fēng)險(xiǎn)的權(quán)衡
Sanger測(cè)序每個(gè)反應(yīng)需要額外的經(jīng)費(fèi)，驗(yàn)證流程可能使報(bào)告延遲幾天到一周。但比起錯(cuò)誤診斷帶來的代價(jià)，這些成本微不足道。
一次假陽性報(bào)告可能導(dǎo)致不必要的治療，甚至手術(shù)。而一次假陰性則可能讓患者錯(cuò)過早期干預(yù)的機(jī)會(huì)。
對(duì)于研究項(xiàng)目，未經(jīng)驗(yàn)證的陽性結(jié)果可能導(dǎo)致整個(gè)研究方向的錯(cuò)誤，浪費(fèi)數(shù)月甚至數(shù)年的工作時(shí)間。在論文評(píng)審過程中，審稿人通常也會(huì)提出這方面的要求。
一、技術(shù)盲區(qū)
NGS的強(qiáng)大毋庸置疑，但它并非完美無缺。這項(xiàng)技術(shù)本質(zhì)上是將基因組打碎成片段進(jìn)行測(cè)序，然后通過計(jì)算重新組裝。在這個(gè)過程中，某些基因組區(qū)域會(huì)成為技術(shù)的“盲區(qū)”。
重復(fù)區(qū)域是最典型的問題�；蛐蛄兄锌赡苓B續(xù)出現(xiàn)7、8個(gè)相同的堿基（如AAAAAAA），當(dāng)NGS的短讀長(zhǎng)跨越這些區(qū)域時(shí)，準(zhǔn)確判斷重復(fù)次數(shù)變得異常困難。
高GC含量區(qū)域是另一個(gè)挑戰(zhàn)。GC堿基對(duì)結(jié)合更加緊密，使得這些區(qū)域在測(cè)序文庫制備中難以處理，常常導(dǎo)致覆蓋不足或完全缺失。
同源序列則難以區(qū)分。短讀長(zhǎng)無法跨越高度同源區(qū)域，難以找到唯一比對(duì)位置，算法可能比對(duì)到序列的錯(cuò)誤位置，產(chǎn)生誤導(dǎo)性結(jié)果。
染色體結(jié)構(gòu)變異同樣棘手，當(dāng)遇到大片段的插入、缺失、倒位或重復(fù)時(shí)，NGS很難精確定位變異的起點(diǎn)和終點(diǎn)。
這些技術(shù)局限性不是理論上的擔(dān)憂。而2019年《Journal of Molecular Diagnostics》的一項(xiàng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，一些實(shí)驗(yàn)室的NGS檢測(cè)結(jié)果，超過2%（特別是插入/缺失）是錯(cuò)誤的，這樣的錯(cuò)誤集中出現(xiàn)在上述的技術(shù)盲區(qū)。
二、驗(yàn)證金標(biāo)準(zhǔn)
當(dāng)NGS標(biāo)記出一個(gè)陽性突變時(shí)，尤其是位于上述高風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域的突變，一代測(cè)序仍然是無可爭(zhēng)議的“金標(biāo)準(zhǔn)”。與NGS的間接推斷不同，Sanger測(cè)序產(chǎn)生的是直觀、連續(xù)的序列數(shù)據(jù)，以清晰的峰圖形式呈現(xiàn)。
驗(yàn)證的必要性已經(jīng)滲透到行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和指南中。美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)在其技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)中明確指出：“對(duì)于用于臨床診斷的NGS檢測(cè)，應(yīng)使用正交方法驗(yàn)證所有致病和可能致病變異。”
歐洲分子基因診斷質(zhì)量聯(lián)盟的指南則更加具體：“對(duì)于NGS檢測(cè)到的序列變異，特別是位于復(fù)雜基因組區(qū)域的變異，應(yīng)使用Sanger測(cè)序進(jìn)行確認(rèn)。”
三、系統(tǒng)性驗(yàn)證
在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)階段，前瞻性規(guī)劃驗(yàn)證策略。這包括在樣本預(yù)算中預(yù)留驗(yàn)證專用材料，專門的經(jīng)費(fèi)和實(shí)驗(yàn)時(shí)間。
在數(shù)據(jù)分析階段，實(shí)施風(fēng)險(xiǎn)分層評(píng)估。不是所有變異都需要同等級(jí)別的驗(yàn)證�？梢愿鶕�(jù)變異類型、基因組位置和臨床重要性建立分層驗(yàn)證方案：位于高風(fēng)險(xiǎn)復(fù)雜區(qū)域的陽性突變需要驗(yàn)證；新發(fā)現(xiàn)的且預(yù)測(cè)為目標(biāo)的突變需要驗(yàn)證；用于指導(dǎo)關(guān)鍵治療決策的變異必須驗(yàn)證。
對(duì)于臨床實(shí)驗(yàn)室，還有額外的質(zhì)量控制要求。許多認(rèn)證機(jī)構(gòu)要求實(shí)驗(yàn)室定期進(jìn)行陽性樣本的再驗(yàn)證，確保整個(gè)檢測(cè)流程的持續(xù)準(zhǔn)確性。人員培訓(xùn)也至關(guān)重要——技術(shù)人員必須能夠正確解讀Sanger測(cè)序峰圖，識(shí)別可能的偽影。
四、成本與風(fēng)險(xiǎn)的權(quán)衡
Sanger測(cè)序每個(gè)反應(yīng)需要額外的經(jīng)費(fèi)，驗(yàn)證流程可能使報(bào)告延遲幾天到一周。但比起錯(cuò)誤診斷帶來的代價(jià)，這些成本微不足道。
一次假陽性報(bào)告可能導(dǎo)致不必要的治療，甚至手術(shù)。而一次假陰性則可能讓患者錯(cuò)過早期干預(yù)的機(jī)會(huì)。
對(duì)于研究項(xiàng)目，未經(jīng)驗(yàn)證的陽性結(jié)果可能導(dǎo)致整個(gè)研究方向的錯(cuò)誤，浪費(fèi)數(shù)月甚至數(shù)年的工作時(shí)間。在論文評(píng)審過程中，審稿人通常也會(huì)提出這方面的要求。
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