內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為真核細(xì)胞中蛋白質(zhì)合成、折疊及修飾的核心細(xì)胞器，其功能穩(wěn)態(tài)對(duì)細(xì)胞存活至關(guān)重要。當(dāng)細(xì)胞遭遇缺氧、營(yíng)養(yǎng)匱乏、感染或氧化應(yīng)激等不良刺激時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)大量積累，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress, ERS）。作為細(xì)胞的適應(yīng)性保護(hù)機(jī)制，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過激活三條核心未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response, UPR）信號(hào)通路（PERK通路、IRE1通路、ATF6通路）調(diào)控蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)，而持續(xù)或劇烈的應(yīng)激反應(yīng)則會(huì)啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序清除受損細(xì)胞。

一、 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的生物學(xué)本質(zhì)
內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)質(zhì)量控制的關(guān)鍵場(chǎng)所，新合成的多肽鏈需在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中完成正確折疊與糖基化修飾。正常生理狀態(tài)下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通過分子伴侶（如BiP/GRP78）與折疊酶的協(xié)同作用，維持蛋白質(zhì)折疊效率與錯(cuò)誤折疊蛋白降解之間的動(dòng)態(tài)平衡。當(dāng)外界刺激干擾這一平衡時(shí)，未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中異常蓄積，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂，進(jìn)而觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的核心生物學(xué)意義在于"適應(yīng)性保護(hù)"與"損傷清除"的雙向調(diào)控：輕度應(yīng)激時(shí)，細(xì)胞通過激活UPR通路增強(qiáng)蛋白質(zhì)折疊能力、抑制新蛋白合成、促進(jìn)異常蛋白降解，以恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)；當(dāng)應(yīng)激持續(xù)時(shí)間過長(zhǎng)或強(qiáng)度超過細(xì)胞耐受閾值時(shí)，UPR通路則會(huì)啟動(dòng)凋亡信號(hào)，清除功能不可逆損傷的細(xì)胞，避免其對(duì)機(jī)體造成更大危害。

Chen X, Shi C,et al. Endoplasmic reticulum stress: molecular mechanism and therapeutic targets. Signal Transduct Target Ther. 2023 Sep 15;8(1):352.

二、 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激核心信號(hào)通路調(diào)控機(jī)制
內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的分子調(diào)控主要依賴三條相互協(xié)作的UPR信號(hào)通路，均通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白感知未折疊蛋白積累并啟動(dòng)下游信號(hào)傳導(dǎo)：

（一）PERK通路（蛋白質(zhì)翻譯抑制與凋亡調(diào)控通路）
1. 激活機(jī)制：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，未折疊蛋白與BiP分子伴侶分離，BiP與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜激酶PERK（雙鏈RNA激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶）結(jié)合，誘導(dǎo)PERK發(fā)生二聚化與自身磷酸化激活。

2. 下游信號(hào)傳導(dǎo)：激活的PERK可特異性磷酸化真核翻譯起始因子eIF2α，使其喪失啟動(dòng)蛋白質(zhì)翻譯的活性，從而全局抑制細(xì)胞內(nèi)mRNA的翻譯起始，減少新合成蛋白質(zhì)對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的負(fù)擔(dān)。同時(shí)，eIF2α磷酸化可選擇性增強(qiáng)ATF4（激活轉(zhuǎn)錄因子4）等特定轉(zhuǎn)錄因子的翻譯效率。

3. 生物學(xué)效應(yīng)：ATF4進(jìn)入細(xì)胞核后，可激活氨基酸代謝、抗氧化反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)，幫助細(xì)胞適應(yīng)應(yīng)激環(huán)境；同時(shí)也可上調(diào)CHOP等凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，在應(yīng)激過載時(shí)啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞存活的雙向調(diào)控。

（二）IRE1通路（mRNA剪切與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控通路）
1. 激活機(jī)制：IRE1（肌醇需求酶1）作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白激酶，在未折疊蛋白與BiP分離后發(fā)生寡聚化激活，獲得RNase活性。

2. 下游信號(hào)傳導(dǎo)：激活的IRE1可特異性剪切XBP1（X箱結(jié)合蛋白1）mRNA，切除26或24個(gè)核苷酸的內(nèi)含子片段，形成具有轉(zhuǎn)錄活性的XBP1s（剪切型XBP1）mRNA。此外，IRE1還可通過結(jié)合TRAF2、ASK1等蛋白激活JNK信號(hào)通路。

3. 生物學(xué)效應(yīng)：XBP1s經(jīng)翻譯后進(jìn)入細(xì)胞核，激活蛋白質(zhì)折疊、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解（ERAD）、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)等過程相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，顯著增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的適應(yīng)能力；而JNK通路的激活則可調(diào)控細(xì)胞凋亡或存活相關(guān)基因的表達(dá)，參與應(yīng)激反應(yīng)的結(jié)局調(diào)控。

（三）ATF6通路（轉(zhuǎn)錄因子激活通路）

Chen X, Shi C,et al. Endoplasmic reticulum stress: molecular mechanism and therapeutic targets. Signal Transduct Target Ther. 2023 Sep 15;8(1):352.  

1. 激活機(jī)制：正常狀態(tài)下，ATF6（激活轉(zhuǎn)錄因子6）與BiP結(jié)合處于非活化狀態(tài)；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，BiP與ATF6解離，暴露ATF6的疏水結(jié)構(gòu)域，使其從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體，經(jīng)S1P和S2P蛋白酶分步切割，產(chǎn)生具有轉(zhuǎn)錄活性的ATF6 N端片段（ATF6f）。

2. 下游信號(hào)傳導(dǎo)：ATF6f進(jìn)入細(xì)胞核后，特異性結(jié)合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)元件（ERSE），促進(jìn)XBP1、BiP等UPR靶分子及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的基因轉(zhuǎn)錄。

3. 生物學(xué)效應(yīng)：通過增強(qiáng)分子伴侶的表達(dá)與蛋白質(zhì)折疊相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)一步提升內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白折疊能力，幫助細(xì)胞恢復(fù)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激適應(yīng)性反應(yīng)的重要補(bǔ)充。

三條信號(hào)通路并非孤立存在，而是通過共享靶基因（如XBP1、BiP）和交叉調(diào)控節(jié)點(diǎn)（如ATF4與ATF6的協(xié)同作用）形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共同應(yīng)對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激挑戰(zhàn)。

三、 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證技術(shù)體系
內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的驗(yàn)證需結(jié)合分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法，從基因轉(zhuǎn)錄、蛋白表達(dá)與修飾、細(xì)胞功能及動(dòng)物表型等多維度開展，關(guān)鍵技術(shù)如下：

（一）分子生物學(xué)驗(yàn)證方法
1. 基因轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)
實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR）：通過設(shè)計(jì)特異性引物，檢測(cè)BiP、CHOP、XBP1、ATF4等核心基因的mRNA表達(dá)量。常用衣霉素（tunicamycin）或毒胡蘿卜素（thapsigargin）作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑，若處理后目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)，可初步判定內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及相關(guān)通路激活。

RNA-seq：通過高通量測(cè)序分析應(yīng)激狀態(tài)下的全基因組表達(dá)譜，對(duì)比正常樣本篩選差異表達(dá)基因，挖掘潛在的新型調(diào)控分子及信號(hào)通路，適用于機(jī)制探索性研究。          

2. 蛋白表達(dá)與修飾檢測(cè)
Western Blot：核心檢測(cè)指標(biāo)包括通路關(guān)鍵蛋白（PERK、IRE1、ATF6）的表達(dá)量及其磷酸化水平，下游效應(yīng)分子（eIF2α、p-eIF2α、ATF4、CHOP、XBP1s）的表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)需根據(jù)蛋白定位選擇合適的樣本處理方式：    

總蛋白提取：適用于BiP、CHOP、eIF2α等分布廣泛的蛋白，操作簡(jiǎn)便可快速反映整體表達(dá)水平；

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白分離：針對(duì)PERK、IRE1α、Calnexin等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位蛋白，采用密度梯度離心或?qū)Ｓ梅蛛x試劑盒富集內(nèi)質(zhì)網(wǎng)組分，提高檢測(cè)特異性；

高爾基體蛋白分離：用于研究ATF6在高爾基體中的切割激活過程；

細(xì)胞核蛋白分離：適用于ATF6f、XBP1s等轉(zhuǎn)錄因子，可檢測(cè)其在細(xì)胞核內(nèi)的積累情況。免疫共沉淀（Co-IP）：驗(yàn)證通路中蛋白-蛋白相互作用，如IRE1與TRAF2、ASK1的結(jié)合增強(qiáng)可提示IRE1-JNK凋亡通路激活。

雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)：構(gòu)建含ERSE元件或XBP1、CHOP等基因啟動(dòng)子的報(bào)告質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后通過熒光素酶活性變化，直接反映靶基因啟動(dòng)子活性及通路激活狀態(tài)。

（二）細(xì)胞生物學(xué)驗(yàn)證方法
熒光報(bào)告基因檢測(cè)：將mCherry等熒光蛋白與PERK、IRE1等通路蛋白融合表達(dá)，通過熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀觀察應(yīng)激狀態(tài)下熒光信號(hào)的定位變化與強(qiáng)度增強(qiáng)，直觀反映蛋白激活狀態(tài)。

細(xì)胞活性與凋亡檢測(cè)：采用CCK-8、MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性，流式細(xì)胞儀（Annexin V/PI染色）檢測(cè)凋亡率。若應(yīng)激誘導(dǎo)后細(xì)胞活性下降、凋亡率升高，且CHOP、BAX等凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)增加，提示應(yīng)激過載導(dǎo)致凋亡通路激活。

鈣離子濃度檢測(cè)：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞鈣儲(chǔ)存庫(kù)，應(yīng)激時(shí)鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)。利用Fluo-3/AM或Indo-1/AM等熒光鈣指示劑，通過熒光成像技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞質(zhì)中鈣離子濃度升高，可作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生的重要指標(biāo)。

（三）體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證方法
疾病相關(guān)動(dòng)物模型：構(gòu)建高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖模型、化學(xué)藥物誘導(dǎo)的器官損傷模型等，檢測(cè)肝臟、胰腺等靶器官中BiP、CHOP、PERK等分子的表達(dá)變化，驗(yàn)證內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用。

基因修飾動(dòng)物模型：通過基因工程技術(shù)構(gòu)建ATF6、IRE1等關(guān)鍵基因的敲除或過表達(dá)小鼠，觀察其對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑的反應(yīng)性及疾病易感性。若基因敲除小鼠表現(xiàn)出應(yīng)激敏感性增加或疾病表型加重，可明確該基因在通路中的核心功能。  

四、 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激研究實(shí)驗(yàn)服務(wù)哪里有
內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過PERK、IRE1、ATF6三條核心通路構(gòu)建的精密調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，是細(xì)胞應(yīng)對(duì)蛋白折疊紊亂的關(guān)鍵防線，其功能失衡與肥胖、糖尿病、神經(jīng)退行性疾病等重大疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，成為生命科學(xué)領(lǐng)域的核心研究方向之一。在該領(lǐng)域的機(jī)制探索與靶點(diǎn)驗(yàn)證中，實(shí)驗(yàn)技術(shù)的全面性與精準(zhǔn)性直接決定研究深度——LabEx依托覆蓋基因、蛋白、細(xì)胞、組織多層面的30+成熟技術(shù)平臺(tái)，為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激研究提供全流程解決方案：通過qPCR、PCR Array等技術(shù)可快速量化BiP、CHOP、XBP1等核心基因的轉(zhuǎn)錄變化，Western Blot結(jié)合蛋白芯片、抗體芯片能精準(zhǔn)檢測(cè)PERK、IRE1磷酸化及ATF4、CHOP等下游蛋白的表達(dá)修飾，而細(xì)胞功能檢測(cè)、多重免疫組化、空間多組學(xué)等技術(shù)則可實(shí)現(xiàn)從細(xì)胞動(dòng)態(tài)應(yīng)激反應(yīng)到組織病理關(guān)聯(lián)的多維驗(yàn)證。從基礎(chǔ)機(jī)制研究到生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)，LabEx將持續(xù)以標(biāo)準(zhǔn)化操作流程、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臄?shù)據(jù)管理體系及高效的技術(shù)支持，為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)研究提供從實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)到數(shù)據(jù)分析的一站式服務(wù)，加速科研成果向疾病診斷與治療轉(zhuǎn)化的進(jìn)程。

樂備實(shí)是國(guó)內(nèi)專注于提供高質(zhì)量蛋白檢測(cè)以及組學(xué)分析服務(wù)的實(shí)驗(yàn)服務(wù)專家，自2018年成立以來(lái)，樂備實(shí)不斷尋求突破，公司的服務(wù)技術(shù)平臺(tái)已擴(kuò)展到單細(xì)胞測(cè)序、空間多組學(xué)、流式檢測(cè)、超敏電化學(xué)發(fā)光、Luminex多因子檢測(cè)、抗體芯片、PCR Array、ELISA、Elispot、PLA蛋白互作、多色免疫組化、DSP空間多組學(xué)等30多個(gè)，建立起了一套涵蓋基因、蛋白、細(xì)胞以及組織水平實(shí)驗(yàn)的完整檢測(cè)體系。