內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為真核細胞中蛋白質(zhì)合成、折疊及修飾的核心細胞器，其功能穩(wěn)態(tài)對細胞存活至關重要。當細胞遭遇缺氧、營養(yǎng)匱乏、感染或氧化應激等不良刺激時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊或錯誤折疊蛋白質(zhì)大量積累，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激（endoplasmic reticulum stress, ERS）。作為細胞的適應性保護機制，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激通過激活三條核心未折疊蛋白反應（unfolded protein response, UPR）信號通路（PERK通路、IRE1通路、ATF6通路）調(diào)控蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)，而持續(xù)或劇烈的應激反應則會啟動細胞凋亡程序清除受損細胞。

一、 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的生物學本質(zhì)
內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細胞內(nèi)蛋白質(zhì)質(zhì)量控制的關鍵場所，新合成的多肽鏈需在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中完成正確折疊與糖基化修飾。正常生理狀態(tài)下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通過分子伴侶（如BiP/GRP78）與折疊酶的協(xié)同作用，維持蛋白質(zhì)折疊效率與錯誤折疊蛋白降解之間的動態(tài)平衡。當外界刺激干擾這一平衡時，未折疊或錯誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中異常蓄積，導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂，進而觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應。 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的核心生物學意義在于"適應性保護"與"損傷清除"的雙向調(diào)控：輕度應激時，細胞通過激活UPR通路增強蛋白質(zhì)折疊能力、抑制新蛋白合成、促進異常蛋白降解，以恢復內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)；當應激持續(xù)時間過長或強度超過細胞耐受閾值時，UPR通路則會啟動凋亡信號，清除功能不可逆損傷的細胞，避免其對機體造成更大危害。

Chen X, Shi C,et al. Endoplasmic reticulum stress: molecular mechanism and therapeutic targets. Signal Transduct Target Ther. 2023 Sep 15;8(1):352.

二、 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激核心信號通路調(diào)控機制
內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的分子調(diào)控主要依賴三條相互協(xié)作的UPR信號通路，均通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白感知未折疊蛋白積累并啟動下游信號傳導：

（一）PERK通路（蛋白質(zhì)翻譯抑制與凋亡調(diào)控通路）
1. 激活機制：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激時，未折疊蛋白與BiP分子伴侶分離，BiP與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜激酶PERK（雙鏈RNA激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶）結(jié)合，誘導PERK發(fā)生二聚化與自身磷酸化激活。

2. 下游信號傳導：激活的PERK可特異性磷酸化真核翻譯起始因子eIF2α，使其喪失啟動蛋白質(zhì)翻譯的活性，從而全局抑制細胞內(nèi)mRNA的翻譯起始，減少新合成蛋白質(zhì)對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的負擔。同時，eIF2α磷酸化可選擇性增強ATF4（激活轉(zhuǎn)錄因子4）等特定轉(zhuǎn)錄因子的翻譯效率。

3. 生物學效應：ATF4進入細胞核后，可激活氨基酸代謝、抗氧化反應相關基因的表達，幫助細胞適應應激環(huán)境；同時也可上調(diào)CHOP等凋亡相關基因的轉(zhuǎn)錄，在應激過載時啟動細胞凋亡程序，實現(xiàn)對細胞存活的雙向調(diào)控。

（二）IRE1通路（mRNA剪切與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控通路）
1. 激活機制：IRE1（肌醇需求酶1）作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白激酶，在未折疊蛋白與BiP分離后發(fā)生寡聚化激活，獲得RNase活性。

2. 下游信號傳導：激活的IRE1可特異性剪切XBP1（X箱結(jié)合蛋白1）mRNA，切除26或24個核苷酸的內(nèi)含子片段，形成具有轉(zhuǎn)錄活性的XBP1s（剪切型XBP1）mRNA。此外，IRE1還可通過結(jié)合TRAF2、ASK1等蛋白激活JNK信號通路。

3. 生物學效應：XBP1s經(jīng)翻譯后進入細胞核，激活蛋白質(zhì)折疊、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關降解（ERAD）、蛋白轉(zhuǎn)運等過程相關基因的轉(zhuǎn)錄，顯著增強細胞對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的適應能力；而JNK通路的激活則可調(diào)控細胞凋亡或存活相關基因的表達，參與應激反應的結(jié)局調(diào)控。

（三）ATF6通路（轉(zhuǎn)錄因子激活通路）

Chen X, Shi C,et al. Endoplasmic reticulum stress: molecular mechanism and therapeutic targets. Signal Transduct Target Ther. 2023 Sep 15;8(1):352.  

1. 激活機制：正常狀態(tài)下，ATF6（激活轉(zhuǎn)錄因子6）與BiP結(jié)合處于非活化狀態(tài)；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激時，BiP與ATF6解離，暴露ATF6的疏水結(jié)構(gòu)域，使其從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運至高爾基體，經(jīng)S1P和S2P蛋白酶分步切割，產(chǎn)生具有轉(zhuǎn)錄活性的ATF6 N端片段（ATF6f）。

2. 下游信號傳導：ATF6f進入細胞核后，特異性結(jié)合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應元件（ERSE），促進XBP1、BiP等UPR靶分子及相關轉(zhuǎn)錄因子的基因轉(zhuǎn)錄。

3. 生物學效應：通過增強分子伴侶的表達與蛋白質(zhì)折疊相關基因的轉(zhuǎn)錄，進一步提升內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白折疊能力，幫助細胞恢復蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激適應性反應的重要補充。

三條信號通路并非孤立存在，而是通過共享靶基因（如XBP1、BiP）和交叉調(diào)控節(jié)點（如ATF4與ATF6的協(xié)同作用）形成復雜的調(diào)控網(wǎng)絡，共同應對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激挑戰(zhàn)。

三、 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的實驗驗證技術(shù)體系
內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的驗證需結(jié)合分子生物學、細胞生物學及體內(nèi)實驗方法，從基因轉(zhuǎn)錄、蛋白表達與修飾、細胞功能及動物表型等多維度開展，關鍵技術(shù)如下：

（一）分子生物學驗證方法
1. 基因轉(zhuǎn)錄水平檢測
實時定量PCR（qPCR）：通過設計特異性引物，檢測BiP、CHOP、XBP1、ATF4等核心基因的mRNA表達量。常用衣霉素（tunicamycin）或毒胡蘿卜素（thapsigargin）作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導劑，若處理后目標基因轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)，可初步判定內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激及相關通路激活。

RNA-seq：通過高通量測序分析應激狀態(tài)下的全基因組表達譜，對比正常樣本篩選差異表達基因，挖掘潛在的新型調(diào)控分子及信號通路，適用于機制探索性研究。          

2. 蛋白表達與修飾檢測
Western Blot：核心檢測指標包括通路關鍵蛋白（PERK、IRE1、ATF6）的表達量及其磷酸化水平，下游效應分子（eIF2α、p-eIF2α、ATF4、CHOP、XBP1s）的表達變化。實驗需根據(jù)蛋白定位選擇合適的樣本處理方式：    

總蛋白提�。哼m用于BiP、CHOP、eIF2α等分布廣泛的蛋白，操作簡便可快速反映整體表達水平；

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白分離：針對PERK、IRE1α、Calnexin等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位蛋白，采用密度梯度離心或?qū)Ｓ梅蛛x試劑盒富集內(nèi)質(zhì)網(wǎng)組分，提高檢測特異性；

高爾基體蛋白分離：用于研究ATF6在高爾基體中的切割激活過程；

細胞核蛋白分離：適用于ATF6f、XBP1s等轉(zhuǎn)錄因子，可檢測其在細胞核內(nèi)的積累情況。免疫共沉淀（Co-IP）：驗證通路中蛋白-蛋白相互作用，如IRE1與TRAF2、ASK1的結(jié)合增強可提示IRE1-JNK凋亡通路激活。

雙熒光素酶報告基因檢測：構(gòu)建含ERSE元件或XBP1、CHOP等基因啟動子的報告質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染細胞后通過熒光素酶活性變化，直接反映靶基因啟動子活性及通路激活狀態(tài)。

（二）細胞生物學驗證方法
熒光報告基因檢測：將mCherry等熒光蛋白與PERK、IRE1等通路蛋白融合表達，通過熒光顯微鏡或流式細胞儀觀察應激狀態(tài)下熒光信號的定位變化與強度增強，直觀反映蛋白激活狀態(tài)。

細胞活性與凋亡檢測：采用CCK-8、MTT法檢測細胞活性，流式細胞儀（Annexin V/PI染色）檢測凋亡率。若應激誘導后細胞活性下降、凋亡率升高，且CHOP、BAX等凋亡相關蛋白表達增加，提示應激過載導致凋亡通路激活。

鈣離子濃度檢測：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細胞鈣儲存庫，應激時鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)。利用Fluo-3/AM或Indo-1/AM等熒光鈣指示劑，通過熒光成像技術(shù)檢測細胞質(zhì)中鈣離子濃度升高，可作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激發(fā)生的重要指標。

（三）體內(nèi)實驗驗證方法
疾病相關動物模型：構(gòu)建高脂飲食誘導的肥胖模型、化學藥物誘導的器官損傷模型等，檢測肝臟、胰腺等靶器官中BiP、CHOP、PERK等分子的表達變化，驗證內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用。

基因修飾動物模型：通過基因工程技術(shù)構(gòu)建ATF6、IRE1等關鍵基因的敲除或過表達小鼠，觀察其對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導劑的反應性及疾病易感性。若基因敲除小鼠表現(xiàn)出應激敏感性增加或疾病表型加重，可明確該基因在通路中的核心功能。  

四、 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激研究實驗服務哪里有
內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激通過PERK、IRE1、ATF6三條核心通路構(gòu)建的精密調(diào)控網(wǎng)絡，是細胞應對蛋白折疊紊亂的關鍵防線，其功能失衡與肥胖、糖尿病、神經(jīng)退行性疾病等重大疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關，成為生命科學領域的核心研究方向之一。在該領域的機制探索與靶點驗證中，實驗技術(shù)的全面性與精準性直接決定研究深度——LabEx依托覆蓋基因、蛋白、細胞、組織多層面的30+成熟技術(shù)平臺，為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激研究提供全流程解決方案：通過qPCR、PCR Array等技術(shù)可快速量化BiP、CHOP、XBP1等核心基因的轉(zhuǎn)錄變化，Western Blot結(jié)合蛋白芯片、抗體芯片能精準檢測PERK、IRE1磷酸化及ATF4、CHOP等下游蛋白的表達修飾，而細胞功能檢測、多重免疫組化、空間多組學等技術(shù)則可實現(xiàn)從細胞動態(tài)應激反應到組織病理關聯(lián)的多維驗證。從基礎機制研究到生物標志物發(fā)現(xiàn)，LabEx將持續(xù)以標準化操作流程、嚴謹?shù)臄?shù)據(jù)管理體系及高效的技術(shù)支持，為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關研究提供從實驗設計到數(shù)據(jù)分析的一站式服務，加速科研成果向疾病診斷與治療轉(zhuǎn)化的進程。

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