據統計，當今世界約有8億精神疾病患者，而這一數字還在持續(xù)增長。精神疾病的癥狀嚴重影響著病人的生活，致使他們經常被污名化，他們的自殺風險估計至少比普通公眾高十倍。

對于科學家來說，精神疾病的異質性也給研究帶來了不小的挑戰(zhàn)：具有相同診斷的患者在癥狀、治療藥物和基因方面表現出極大的差異。因此，深入了解這些疾病的細胞和分子結構不僅對理解該疾病至關重要，而且對它們的發(fā)展和治療也至關重要。

本期推送為大家?guī)�來一篇關于精神分裂癥（Scz）的研究論文，該研究利用單細胞測序等技術深入研究了Scz的神經發(fā)育途徑。

基本信息

文章題目：Schizophrenia is defined by cell-specific neuropathology and multiple neurodevelopmental mechanisms in patient-derived cerebral organoids

發(fā)表時間：2022年3月

發(fā)表期刊：MOL PSYCHIATR（IF=15.992）

關鍵詞：神經分裂癥，單細胞轉錄組學，蛋白質組學

研究方法：高通量流式細胞術，液相色譜-質譜（LC/MS），scRNA-seq，激光掃描共焦顯微鏡

發(fā)表單位：美國康奈爾大學醫(yī)學院

文章摘要 

研究利用患者源性誘導多能干細胞（iPSCs）生成3D類腦器官來模擬在這一關鍵時期精神分裂癥（Scz）的神經病理學。

研究者發(fā)現Scz類器官表現出腦室神經病理學，導致祖細胞存活率改變和神經發(fā)生中斷。這最終在Scz類器官發(fā)育的皮質區(qū)內產生較少的神經元。單細胞測序顯示，Scz祖細胞特異性缺乏神經元編程因子，導致細胞譜系重塑、分化軌跡改變和皮質細胞類型多樣性扭曲。雖然Scz類器官的大分子多樣性與健康對照（CTRL）產生的類器官相似，但四種GWAS因子（PTN、COMT、PLCL1和PODXL）和屬于POU域轉錄因子家族的肽片段（例如POU3F2/BRN2）發(fā)生了改變。這表明，Scz類器官的主要差異不在于其蛋白質組多樣性，而在于其在分子水平上的疾病總量和神經發(fā)育因子。隨后，單細胞測序確定了神經元編程因子的細胞類型特異性改變以及神經營養(yǎng)生長因子表達的發(fā)育開關，表明Scz神經病理學可以在細胞類型的基礎上進行編碼。此外，單細胞測序還特異性復制了Scz祖細胞和神經元中BRN2（POU3F2）和PTN的缺失。隨后，在兩個挽救實驗中，發(fā)現轉錄因子BRN2和生長因子PTN分別作為Scz類器官中神經發(fā)生和細胞存活的機制性底物。

總之，研究表明，Scz的多種機制存在于患者衍生的類器官中，并且這些不同的機制集中于原始的大腦發(fā)育途徑，如神經元分化、存活和生長因子支持，這些途徑可能合并以提高Scz的內在風險。

研究結果 

■患者源性Scz類器官表現出腦室熵和神經病理學特征

首先，研究者采用了一種無形態(tài)因子的類器官方案，可包含感興趣的細胞類型，同時避免了外源性形態(tài)因子暴露導致的潛在混雜效應。因此，從健康對照組和特發(fā)性Scz患者中生成3D大腦類器官。利用免疫組化和激光共聚焦顯微鏡技術發(fā)現，與對照類器官相似，Scz類器官也表現出廣泛的神經誘導，其特征是NESTIN+纖維和SOX2+前體細胞富集的腦室區(qū)域的存在（圖1b）。然而，Scz比對照的腦室區(qū)域更小，充滿神經元的皮質區(qū)也更稀疏，表明Scz祖細胞可能過早死亡或無法啟動神經發(fā)生。對iPSC供體的祖細胞死亡分析發(fā)現Scz腦室祖細胞死亡顯著增加，且其皮質區(qū)內神經元數量顯著減少（圖1c和d）。通過BrdU脈沖追蹤實驗發(fā)現在相同的區(qū)域里，經歷神經元分化或祖細胞自我更新的BrdU+增殖祖細胞的比例。在對照類器官中，祖細胞在追蹤期間主要分化為早期的神經元，而Scz則表現出顯著的神經發(fā)生障礙（圖1e）。綜上所述，Scz類器官中的神經元丟失是由細胞凋亡增加和神經發(fā)生減少的共同作用引起的。

● 圖1 Scz患者源性類器官中的腦室祖細胞被破壞

■ 患者源性Scz類器官表現出腦室熵和神經病理學特征

為了繪制3D人衍生類器官的蛋白質組，研究采用串聯質量標記（TMT）技術對從對照和Scz大腦類器官中分離的肽進行全局條形碼標記，可進行定量液相色譜-質譜分析（LC-MS）（圖2a）。該方法鑒定了3772個蛋白質。研究發(fā)現，對照和Scz大腦類器官之間的蛋白幾乎完全重疊，只有兩種蛋白是Scz腦類器官所特有的（圖2b）。因此，盡管非定向性大腦類器官的形態(tài)和外觀各不相同，但其大分子組成相對穩(wěn)定且一致。此外，對照和Scz大腦類器官均表現出豐富的神經元和大腦發(fā)育途徑。雖然對照和Scz中蛋白質的多樣性非常相似，但進一步的計算分析表明，Scz中的多肽數量存在顯著差異。222種蛋白質在對照和Scz類器官之間的表達存在差異（圖2d）。有趣的是，在Scz類器官中鑒定出含有POU結構域轉錄因子的肽片段。結合前人的Scz基因關聯研究，發(fā)現至少約有70種可能的危險蛋白存在與類器官，其中PLCL1、PTN、PODXL和COMT，在Scz類器官中顯著差異表達（圖2e）。這表明Scz的神經病理學主要與具有既定疾病風險的常見分子因素的破壞有關，這可能是更廣泛的調控網絡共同破壞的結果。

● 圖2 蛋白質組學和單細胞轉錄組學鑒定了Scz患者類器官的新疾病特征

■ 單細胞測序顯示Scz類器官中異常的細胞類型多樣性

為了更好地觀察SZ中被破壞的特定細胞類型，研究使用高通量流式細胞術及Chromium single cell 3’平臺進行了單細胞RNA測序（scRNA-seq），以表征皮層細胞類型的多樣性（圖2f）。與早期的發(fā)現相一致的是，與對照組相比，Scz的神經元和祖細胞豐度減少，然而Scz表現出幾種腦相關細胞類型（神經內皮細胞、髓樣細胞等）的異常富集，雖然對照結果中也有這些細胞類型但豐度較低。

■ 擬時分析揭示了Scz類器官細胞譜系的重塑

接下來，研究人員使用scRNA-seq數據進行擬時分析，來推斷發(fā)育過程細胞的分化軌跡或細胞亞型的演化過程（圖3a）。利用這些方法，發(fā)現對照類器官反映了已知神經元編程因子的富集，而Scz類器官則由與多能性、細胞骨架細絲和神經內皮細胞相關的標志物定義。在祖細胞和神經元cluster中的異常標志物過多，損害了其他原型神經元發(fā)育因子和相關的細胞類型。擬時序分析結果表明Scz細胞譜系重塑，即在類器官里從神經元產生中將祖細胞分化轉移出來。

■ SCZ祖細胞和神經元中神經病理的細胞特異性編碼

許多轉錄分化調節(jié)因子在Scz祖細胞中下調，包括軸突發(fā)育途徑因子的耗竭（圖3b）。NT-3或NTF3在Scz祖細胞中表達下調。與擬時序分析一致，Scz祖細胞表現出結構、細絲、黏附和血管生成途徑的異常富集，說明這些祖細胞缺乏一系列促進神經元分化和促進神經元早期發(fā)育的因子。在Scz發(fā)育中的神經元里，與祖細胞類似，一些神經發(fā)育因子、神經絲因子和指導因子的表達下調。奇怪的是，研究者發(fā)現Scz神經元中PI3K-Akt信號和生長因子結合途徑的富集，包括TrkA(NTRK1)受體的下調和神經營養(yǎng)素切割因子FURIN的上調。根據相互作用模型，Scz神經元中上調的IL6ST可能位于FURIN和TrkA的下游（圖3d）。Scz祖細胞的NT-3和神經元中的TrkA下調表明可能存在其他神經營養(yǎng)因子功能障礙的離散模式。更深層的假設驅動分析顯示Scz祖細胞也傾向于下調BDNF但上調NT-4基因的表達，而TrkB(NTRK2)是祖細胞中唯一下調的神經營養(yǎng)素受體（圖3e）。與此相反，Scz神經元只有TrkA的細胞特異性下調。綜上所述，研究者假設在Scz類器官中，不同的細胞特異性神經病理可能匯聚在共同的通路上，導致祖細胞和神經元之間相關但不重疊的Scz細胞特異性神經病理。

● 圖3 Scz類器官的細胞譜系改變和細胞特異性神經病理學

■ 確定BRN2和PTN為類器官的候選疾病因子

為了確定患者來源的類器官中Scz神經病理學的潛在機制因素，研究者確定了蛋白質組靶點是否可以在scRNA-seq轉錄組數據集中得到驗證。進一步對數據進行分析，研究人員觀察到在Scz樣品中BRN2（增加了胚胎發(fā)育中后期神經元的產生）和PTN（靠近GWAS鑒定的Scz相關位點，也促進了細胞的存活以及其他神經發(fā)育過程）的缺失（圖3f和g）。BRN2是一種前腦特異性轉錄因子，在哺乳動物腦中的神經前體細胞和遷移神經元中表達，并在早期皮質神經發(fā)生中發(fā)揮功能作用，可能是Scz神經病理的下游病理生理學底物。BRN2在Scz類器官中的表達增加導致晚期神經元數量增加，但對祖細胞死亡沒有影響，說明BRN2參與Scz類器官的神經元分化但不參與細胞凋亡。PTN被認為通過促進神經元分化在早期皮質新生中發(fā)揮作用。用PTN處理Scz類器官發(fā)現細胞凋亡顯著減少，新生細胞存活率提高，從而顯著增加神經元分化，說明PTN可通過同時促進神經發(fā)生和抑制凋亡來調節(jié)新生細胞的存活，從而調節(jié)Scz腦類器官中的神經元數量。利用BrainCloudTM數據庫進一步挖掘信息發(fā)現BRN2和PTN在產前人腦發(fā)育期間表現出峰值表達，說明它們可能是在這一時期與Scz風險有關的胚胎靶點。

總結 

研究分析了Scz患者來源的3D類器官細胞特異性神經病理和多種機制，從而揭示了獨特的發(fā)育途徑和新的疾病因素機制，這些可能導致在早期皮質生成中Scz的風險。