2025年11月20日，南方科技大學(xué)朱健康院士團(tuán)隊(duì)在《Proc Natl Acad Sci U S A》（PNAS）雜志發(fā)表題為“A chromatin-linked CPL2–PHD2/3 module sustains multiple DNA methylation pathways and Polycomb silencing“的科研成果。研究揭示了植物中名為CPL2-PHD2/3的染色質(zhì)關(guān)聯(lián)功能模塊通過(guò)協(xié)調(diào)多種DNA甲基化通路和Polycomb沉默通路進(jìn)而維持基因組穩(wěn)定性和發(fā)育精確性。

具體而言，研究發(fā)現(xiàn)CPL2（RNA聚合酶II C端結(jié)構(gòu)域Ser5磷酸酶樣蛋白2）與PHD2/3（PHD finger域蛋白）形成一個(gè)獨(dú)立于BAH域蛋白AIPP3的CPL2-PHD2/3功能模塊，此模塊通過(guò)雙重機(jī)制發(fā)揮具體 作用：一方面，該模塊通過(guò)直接互作SUVH4/5蛋白強(qiáng)化SUVH4/5–CMT2反饋環(huán)路，并促進(jìn)RNA介導(dǎo)的DNA甲基化（RdDM）通路，特異性維持轉(zhuǎn)座元件（TE）的CHH DNA甲基化；另一方面，CPL2-PHD2/3作為Polycomb沉默的關(guān)鍵調(diào)控模塊，通過(guò)與LHP1互作或獨(dú)立鑒定低甲基化H3K4，從而導(dǎo)致LHP1功能缺陷位點(diǎn)的基因沉默。該研究首次建立了DNA甲基化通路（靶向TE）與Polycomb沉默（靶向基因）系統(tǒng)之間的功能橋梁，闡明了植物如何通過(guò)一個(gè)多功能樞紐整合不同的表觀遺傳信號(hào)，為理解植物表觀遺傳網(wǎng)絡(luò)如何協(xié)同調(diào)控轉(zhuǎn)座元件沉默與基因表達(dá)提供了全新的調(diào)控機(jī)制。
 

英文標(biāo)題：A chromatin-linked CPL2–PHD2/3 module sustains multiple DNA methylation pathways and Polycomb silencing
中文標(biāo)題：染色質(zhì)相關(guān)的CPL2–PHD2/3模塊維持多種DNA甲基化通路和Polycomb沉默
發(fā)表時(shí)間：2025-11-20
發(fā)表期刊：PNAS
影響因子：IF9.4/Q1
技術(shù)平臺(tái)：WGBS、ChIP-seq、RNA-seq
作者單位：南方科技大學(xué)、美國(guó)普渡大學(xué)、四川農(nóng)業(yè)大學(xué)等

DOI:10.1073/pnas.2523102122

盡管先前的研究結(jié)果已充分闡明多種基于染色質(zhì)的表觀遺傳通路，但其全基因組協(xié)同和互作調(diào)控機(jī)制仍知之甚少。作者先前鑒定出了BAH–PHD–CPL2復(fù)合體，其中AIPP3通過(guò)其BAH域結(jié)合H3K27me3，并與PHD2和PHD3（PHD2/3）協(xié)同，招募CPL2通過(guò)去磷酸化RNA聚合酶II以抑制轉(zhuǎn)錄。

本研究揭示了CPL2與PHD2/3形成一個(gè)獨(dú)特模塊（CPL2–PHD2/3），通過(guò)參與多種DNA甲基化通路以維持CHH DNA甲基化并沉默轉(zhuǎn)座元件（TE）中的CHH甲基化位點(diǎn)。該模塊與SUVH4和SUVH5（SUVH4/5）發(fā)生互作，在部分H3K9me2標(biāo)記區(qū)域維持SUVH4/5–CMT2介導(dǎo)的CHH甲基化。PHD3的染色質(zhì)富集同樣使該模塊能夠在含有H3K9me2、H3K27me3或兩個(gè)標(biāo)記皆不含的位點(diǎn)維持RdDM通路的CHH DNA甲基化。因此，CPL2–PHD2/3成為此前被忽略的植物DNA甲基化網(wǎng)絡(luò)多功能調(diào)控因子。此外，其基因抑制功能與DNA甲基化解偶聯(lián)。有趣的是，CPL2–PHD2/3通過(guò)與LHP1互作或鑒定低甲基化H3K4來(lái)抑制Polycomb標(biāo)記基因，也獨(dú)立沉默了大量LHP1單獨(dú)存在時(shí)無(wú)法抑制的基因，這兩類基因均對(duì)正常發(fā)育至關(guān)重要。這種雙重且?guī)缀醪灰蕾嘗HP1的抑制模式，使CPL2–PHD2/3成為Polycomb沉默的關(guān)鍵調(diào)控因子。

綜上所述，本研究結(jié)果確立了CPL2–PHD2/3作為連接協(xié)同調(diào)控DNA甲基化和Polycomb相關(guān)抑制的染色質(zhì)響應(yīng)整合因子，為多樣化的染色質(zhì)譜中對(duì)TE和基因的表觀遺傳控制提供了統(tǒng)一機(jī)制。

CPL2–PHD2/3介導(dǎo)的表觀遺傳調(diào)控模型。

1. 在部分H3K9me2標(biāo)記位點(diǎn)，CPL2–PHD2/3通過(guò)與SUVH4/5直接互作強(qiáng)化SUVH4/5–CMT2反饋環(huán)路，在跨染色質(zhì)域中維持DNA甲基化。
2. 在其他H3K9me2富集區(qū)域，CPL2–PHD2/3在染色體臂和異染色質(zhì)中促進(jìn)RdDM。RdDM主要通過(guò)SHH1–CLSY1/2–Pol IV分支運(yùn)作，而異染色質(zhì)中CLSY3/4–Pol IV通路作用有限。
3. 在部分H3K27me3標(biāo)記位點(diǎn)，CPL2–PHD2/3維持由SHH1–CLSY1/2–Pol IV分支驅(qū)動(dòng)的RdDM，在兩個(gè)染色體區(qū)域中均發(fā)揮作用。
4. 在大部分H3K9me2和H3K27me3缺失位點(diǎn)，CPL2–PHD2/3支持RdDM，其活性主要由SHH1–CLSY1/2–Pol IV引導(dǎo)，ZMP–CLSY3/4–Pol IV在全基因組范圍內(nèi)發(fā)揮次要作用。
5. 在DNA甲基化水平降低基因位點(diǎn)，CPL2–PHD2/3在強(qiáng)LHP1–H3K27me3標(biāo)記位點(diǎn)顯示中等程度富集（左），但在弱標(biāo)記（中）或無(wú)標(biāo)記（右）位點(diǎn)結(jié)合更強(qiáng)，從而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄抑制。其占位可能同時(shí)依賴于LHP1互作以及對(duì)H3K4me0和H3K4me1的識(shí)別，使其能與LHP1協(xié)同產(chǎn)生差異性調(diào)控效應(yīng)。

• 全基因組DNA甲基化測(cè)序（WGBS）：對(duì)野生型（Col-0）和突變體（cpl2-2, phd2/3C11 , phd2/3C19）進(jìn)行WGBS，在全基因組范圍內(nèi)鑒定CHH、CHG和CG中的差異甲基化區(qū)域（DMRs），特別是關(guān)注CHH hypo-DMRs，以評(píng)估CPL2-PHD2/3模塊對(duì)DNA甲基化的作用。
• 染色質(zhì)免疫沉淀測(cè)序（ChIP-seq）：利用已發(fā)表及本研究產(chǎn)生的ChIP-seq數(shù)據(jù)，分析了多種組蛋白修飾（H3K9me2, H3K27me3, H3K4me1, H3K4me3, H3K9ac, H3K27ac）以及蛋白（如LHP1, PHD3, Pol V）在全基因組上的分布。通過(guò)將DMRs與這些染色質(zhì)狀態(tài)圖譜進(jìn)行整合，闡明了CPL2-PHD2/3模塊發(fā)揮功能的染色質(zhì)環(huán)境。
• RNA測(cè)序（RNA-seq）：對(duì)野生型和突變體進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，鑒定差異表達(dá)基因（DEGs），以評(píng)估CPL2-PHD2/3模塊在轉(zhuǎn)錄沉默中的功能，并將表達(dá)變化與染色質(zhì)狀態(tài)、蛋白結(jié)合數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。
• 多組學(xué)整合分析：對(duì)WGBS、ChIP-seq和RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，包括DMR聚類分析、信號(hào)metaplot分析、不同突變體數(shù)據(jù)集（如nrpe1, nrpd1, cmt2, suvh4/5/6, ddm1等）的交叉比對(duì)，以確定CPL2-PHD2/3調(diào)控的位點(diǎn)依賴于哪條具體的DNA甲基化通路。

3、蛋白互作分析：

• 免疫沉淀-質(zhì)譜聯(lián)用（IP-MS）：鑒定與CPL2、PHD2/3蛋白互作的復(fù)合體成員，發(fā)現(xiàn)其與SUVH4/5、LHP1體內(nèi)互作。
• 分裂熒光素酶互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)（Split-Luc）：在植物體內(nèi)驗(yàn)證CPL2、PHD2/3與SUVH4/5、LHP1之間的直接蛋白互作。
• 酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)（Y2H）：進(jìn)一步驗(yàn)證并精細(xì)定位蛋白互作的結(jié)構(gòu)域。

1. 低甲基化DMRs的CHH甲基化水平。
2. CHH低甲基化DMR的分布。
3. CHH低甲基化DMR相關(guān)TE與所有TE及SIMs的長(zhǎng)度比較。
4. 熱圖顯示CHH低甲基化DMR相關(guān)TE、所有TE和SIMs在不同長(zhǎng)度區(qū)間內(nèi)的歸一化比例。

圖2：CPL2–PHD2/3調(diào)控區(qū)域的染色質(zhì)特征、表達(dá)譜以及與CHH低甲基化DMR的交叉分析。

1. 基于與H3K9me2、H3K27me3或兩者皆缺失的重疊分析，將合并的CHH低甲基化DMR分層為三個(gè)簇。
2. 各簇CHH低甲基化DMR ±1kb范圍內(nèi)指示組蛋白標(biāo)記和RNA Pol II的歸一化ChIP-seq信號(hào)熱圖和metaplot圖，以及比較各簇平均ChIP-seq信號(hào)箱線圖。
3. 小提琴圖顯示各簇和基因型中的轉(zhuǎn)錄水平。
4. CHH低甲基化DMR簇與突變體衍生DMR之間重疊的熱圖。
5. 每個(gè)簇的DMR與suvh4/5/6和nrpe1突變體CHH低甲基化DMR之間的重疊維恩圖。
6. 箱線圖顯示各簇特異性DMR在不同基因型中的CHH甲基化水平。
7. 熱圖展示各簇DMR在不同基因型中的CHH甲基化模式。

圖3：CPL2–PHD2/3模塊根據(jù)不同染色質(zhì)環(huán)境影響CHH DNA甲基化通路。

1. UpSet圖顯示所指示的簇、nrpd1-4和cmt2-7突變體之間共有和特有的CHH低甲基化DMRs。
2. A中DMRs的基因組分布，劃分為近著絲粒異染色質(zhì)和染色體臂。
3. 不同基因型中DMRs（±1 kb）的CHH甲基化水平，按子簇（A）和基因組位置（B）分層。
4. 在所指示的子簇DMRs ±1kb范圍內(nèi)Pol V的ChIP-seq信號(hào)的metaplot圖和熱圖。
5. 箱線圖比較按基因組位置（B）分層的各子簇Pol V的平均ChIP-seq信號(hào)。
6. PHD3相應(yīng)的ChIP-seq分析。
7. IP-MS分析顯示SUVH4與CPL2–PHD2/3模塊共純化箱線圖。
8. SUVH4與CPL2–PHD2/3模塊共純化表。
9. 分裂熒光素酶互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)顯示CPL2–PHD2/3與SUVH4/5在煙草本塞姆氏葉片中的互作。
10. 酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)對(duì)所選互作進(jìn)行驗(yàn)證。

圖4：LHP1與CPL2–PHD2/3模塊物理互作，并以H3K27me3依賴方式定位于PHD2/3調(diào)控基因。

1. UpSet圖顯示所指示突變體之間上調(diào)差異表達(dá)基因（up-DEGs）的共有和獨(dú)特集合。
2. phd2/3C11∩19 up-DEGs在預(yù)定義染色質(zhì)狀態(tài)（CSs）中的富集情況。
3. H3K27me3的ChIP-seq富集分析在CS-2/4/5與所有其他染色質(zhì)狀態(tài)的基因體±1 kb范圍內(nèi)，通過(guò)箱線圖（左）和metaplot圖（右）可視化展示。
4. H3K27me3相關(guān)因子靶向的phd2/3C11∩19 up-DEGs比例，顯示所有up-DEGs（左）及CS-2/4/5或Others亞群中的結(jié)果。
5. LHP1的ChIP-seq富集分析。
6. IP-MS分析顯示LHP1與CPL2一同與PHD2/3共純化。
7. 全長(zhǎng)LHP1及其截短結(jié)構(gòu)域構(gòu)建體的互作實(shí)驗(yàn)示意圖。
8. 分裂熒光素酶互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)顯示LHP1與PHD2/3或CPL2在煙草本塞姆氏葉片中的物理互作。
9. 酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)顯示在含或不含3-AT的選擇性互作。

圖5：CPL2–PHD2/3模塊與LHP1–H3K27me3軸在基因抑制和發(fā)育中的功能性互作

1. UpSet圖顯示所指示突變體中差異表達(dá)基因(DEGs)與已知LHP1靶標(biāo)之間的重疊，其中維恩圖(中部)突出顯示了phd2/3 C11∩19和cpl2-2株系中LHP1靶向的上調(diào)DEGs的交集。
2. Metaplot圖顯示突變體中上調(diào)DEGs上H3K27me3、H3K4me3和H3K4me1的ChIP-seq圖譜。
3. 由LHP1和CPL2–PHD2/3模塊共同調(diào)控的代表性基因的RNA-seq和ChIP-seq信號(hào)IGV圖。
4. 所指示基因型在播種后38天的典型發(fā)育表型。