一、核酸結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)
1、核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)
核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)是指多聚核苷酸鏈中核苷酸的排列順序，亦稱(chēng)為核苷酸序列。連接核苷酸之間的穩(wěn)定共價(jià)鍵為 3‘, 5’-磷酸二酯鍵。一級(jí)結(jié)構(gòu)是核酸攜帶遺傳信息的分子基礎(chǔ)。

2、核酸的二級(jí)結(jié)構(gòu)
DNA最具代表性的二級(jí)結(jié)構(gòu)為雙螺旋結(jié)構(gòu)。其穩(wěn)定性主要依賴于三種非共價(jià)作用力：
氫鍵：位于互補(bǔ)堿基對(duì)（A-T, G-C）之間。
堿基堆積力：相鄰堿基平面間的縱向疏水性相互作用，是維持雙螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的主要力量。
疏水作用：堿基疏水部分避水而趨于螺旋內(nèi)部的作用。

RNA分子也可通過(guò)鏈內(nèi)堿基配對(duì)形成局部的雙螺旋區(qū)等二級(jí)結(jié)構(gòu)。

3、核酸的高級(jí)結(jié)構(gòu)
在二級(jí)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，核酸可進(jìn)一步折疊、盤(pán)曲并與蛋白質(zhì)結(jié)合，形成更復(fù)雜的高級(jí)結(jié)構(gòu)。例如，真核細(xì)胞中的DNA經(jīng)過(guò)多層次壓縮、纏繞，最終與組蛋白等構(gòu)成高度有序的染色體結(jié)構(gòu)。

4、核酸的變性
核酸變性是指在物理（如加熱）或化學(xué)（如極端pH、變性劑）因素作用下，維系DNA雙螺旋二級(jí)結(jié)構(gòu)的氫鍵與堿基堆積力被破壞，導(dǎo)致雙鏈DNA解離為單鏈的過(guò)程。
化學(xué)鍵變化：氫鍵與疏水作用發(fā)生斷裂，此過(guò)程可以是部分或全部、可逆或不可逆。
結(jié)構(gòu)變化：變性本質(zhì)上是空間構(gòu)象（二級(jí)結(jié)構(gòu)）的改變，并不涉及核苷酸序列（一級(jí)結(jié)構(gòu)）的共價(jià)鍵斷裂。

5、核酸的復(fù)性與退火
復(fù)性：指變性分開(kāi)的兩條互補(bǔ)核酸鏈，在去除變性條件后，重新按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則結(jié)合，恢復(fù)雙螺旋結(jié)構(gòu)的過(guò)程。復(fù)性是變性的逆過(guò)程。
退火：特指通過(guò)緩慢冷卻熱變性DNA溶液以實(shí)現(xiàn)復(fù)性的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)方法。此概念可擴(kuò)展應(yīng)用于RNA雙鏈區(qū)或異源核酸雙鏈的重新形成。

6、核酸分子雜交
核酸分子雜交是復(fù)性原理的重要應(yīng)用，指來(lái)源于不同核酸分子的兩條互補(bǔ)單鏈（可以是DNA-DNA、DNA-RNA或RNA-RNA），在適宜條件下通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)形成異源雙鏈復(fù)合體的過(guò)程。

本質(zhì)：在一定條件下，具有序列互補(bǔ)性的不同來(lái)源核酸單鏈間發(fā)生的特異性復(fù)性。該技術(shù)是分子生物學(xué)中鑒定核酸序列同源性、進(jìn)行基因定位與檢測(cè)的核心手段之一。

二、核酸分子雜交的基本原理與類(lèi)型
核酸分子雜交是基于堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，使標(biāo)記的已知序列核酸單鏈（探針）與待測(cè)核酸樣品中的互補(bǔ)序列特異性結(jié)合，形成穩(wěn)定的異源雙鏈，進(jìn)而對(duì)特定靶序列進(jìn)行定性與定量分析的技術(shù)。根據(jù)反應(yīng)體系的狀態(tài)，主要分為兩類(lèi)：
固相雜交：將待測(cè)核酸固定于固相支持物（如尼龍膜、硝酸纖維素膜）上，再與液相中的探針進(jìn)行雜交。
液相雜交：雜交反應(yīng)在溶液中進(jìn)行，待測(cè)核酸與探針均處于游離狀態(tài)。

三、分子雜交的一般流程
標(biāo)準(zhǔn)的核酸分子雜交技術(shù)通常遵循以下操作步驟：
1.探針的制備與標(biāo)記：選擇或合成特異性核酸片段作為探針，并采用同位素（如³²P）或非同位素（如地高辛、生物素、熒光基團(tuán)）方法進(jìn)行標(biāo)記。
2.待測(cè)核酸樣品的制備：從樣本中提取并純化目標(biāo)DNA或RNA，必要時(shí)進(jìn)行酶切、電泳分離等處理。
3.雜交反應(yīng)：在嚴(yán)格控制溫度、離子強(qiáng)度等條件的雜交體系中，使標(biāo)記探針與待測(cè)核酸中的互補(bǔ)序列結(jié)合。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康�，可采用液相、固相或原位雜交等方式。
4.雜交后處理：通過(guò)一系列洗滌步驟，去除未結(jié)合及非特異性結(jié)合的探針，降低背景信號(hào)。
5.結(jié)果檢測(cè)與分析：根據(jù)探針標(biāo)記物類(lèi)別，采用放射自顯影、化學(xué)發(fā)光、熒光檢測(cè)或顯色等方法顯示雜交信號(hào)，并進(jìn)行定性或定量分析。

四、主要雜交技術(shù)及其應(yīng)用
1.反向點(diǎn)雜交：將多種特異性探針預(yù)先固定于膜上，與標(biāo)記的待測(cè)核酸樣品進(jìn)行雜交。主要用于：
基因分型：如人類(lèi)白細(xì)胞抗原分型、人乳頭瘤病毒與丙型肝炎病毒基因分型。
基因突變檢測(cè)：如β-地中海貧血基因突變、苯丙酮尿癥相關(guān)基因突變、結(jié)核分枝桿菌及乙型肝炎病毒耐藥相關(guān)基因突變的篩查。

2.Southern印跡雜交：將經(jīng)凝膠電泳分離的DNA片段轉(zhuǎn)移至固相膜上，再用特異性探針進(jìn)行雜交分析。主要應(yīng)用于：
單基因遺傳病的基因診斷：如鐮狀細(xì)胞貧血癥的診斷。
基因結(jié)構(gòu)分析與點(diǎn)突變檢測(cè)：如特定基因位點(diǎn)突變（如鉀離子通道基因A635G）的鑒定。

3.Northern印跡雜交：其原理與Southern印跡類(lèi)似，但用于分析RNA。主要應(yīng)用于：
RNA病毒的檢測(cè)：如丙型肝炎病毒的鑒定。
基因表達(dá)水平研究：如檢測(cè)特定基因（如乳腺癌相關(guān)基因）在細(xì)胞或組織中的表達(dá)豐度。

4.原位雜交：在組織、細(xì)胞或染色體原位保持其形態(tài)結(jié)構(gòu)的情況下，直接檢測(cè)其中特定核酸序列的技術(shù)。其優(yōu)勢(shì)在于能在形態(tài)學(xué)背景下精確定位核酸。主要應(yīng)用包括：
基因定位：在染色體上對(duì)特定基因進(jìn)行物理作圖。
基因表達(dá)原位分析：檢測(cè)組織或細(xì)胞中特定mRNA的時(shí)空表達(dá)模式。
病原體原位檢測(cè)：在感染組織中直接定位病毒、細(xì)菌等病原體的核酸。

五、影響雜交反應(yīng)的關(guān)鍵因素
雜交實(shí)驗(yàn)的成功與特異性受多種參數(shù)影響，主要包括：
探針特性：探針的類(lèi)型（DNA、RNA、寡核苷酸）、序列特異性、長(zhǎng)度及標(biāo)記效率。
探針濃度：直接影響雜交速率與信號(hào)強(qiáng)度。
雜交動(dòng)力學(xué)：包括雜交速率與反應(yīng)時(shí)間。
雜交嚴(yán)格性：主要由雜交與洗滌過(guò)程中的溫度、離子強(qiáng)度和變性劑濃度（如甲酰胺）決定，用于調(diào)控雜交的特異性。
反應(yīng)促進(jìn)劑：如硫酸葡聚糖或聚乙二醇，可加速液相中核酸的復(fù)性過(guò)程，提高雜交效率。

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