長(zhǎng)期透析造成腹膜纖維化的機(jī)制研究
研究背景
腹膜纖維化是終末期腎病患者接受腹膜透析（PD）時(shí)面臨的主要臨床挑戰(zhàn)，長(zhǎng)期腹膜透析導(dǎo)致患者的腹膜間皮細(xì)胞衰老，但其潛在機(jī)制尚未完全闡明。近期南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院周麗麗、艾軍教授團(tuán)隊(duì)聯(lián)合中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院王成教授團(tuán)隊(duì)在Military Medical Research (IF 22.9)上發(fā)表文章“β-catenin initiates peritoneal fibrosis by triggering mitochondrial fission-mediated mesothelial cell senescence fate transition”，發(fā)現(xiàn)β-catenin-Drp1-TGF-β1軸是腹膜纖維化發(fā)生和進(jìn)展的關(guān)鍵介質(zhì)。
· 維真助力 - AAV·
病毒產(chǎn)品：AAV1-CMV-Cre-GFP；AAV1-control
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：8周齡雄性β-cateninloxP/loxP小鼠
注射方式：腹腔注射
注射量：1× 10^11 vg/g
蛋白印跡和免疫熒光證實(shí)AAV1-Cre成功敲除β-連環(huán)蛋白
結(jié)果展示
1. β-連環(huán)蛋白誘導(dǎo)的線粒體裂變導(dǎo)致間皮細(xì)胞衰老
作者發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期PD患者的腹膜間皮細(xì)胞發(fā)生衰老，并且間皮細(xì)胞中的β-連環(huán)蛋白和TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)增加。作者進(jìn)一步研究了間皮細(xì)胞衰老的關(guān)鍵機(jī)制，發(fā)現(xiàn)在長(zhǎng)期PD患者組中，間皮細(xì)胞中β-連環(huán)蛋白、細(xì)胞衰老信號(hào)傳導(dǎo)和TGF-β的產(chǎn)生增加，并伴隨著與線粒體分裂相關(guān)的基因的上調(diào)。此外透射電子顯微鏡觀察到長(zhǎng)期PD導(dǎo)致間皮細(xì)胞中碎片化的線粒體增加；染色結(jié)果顯示間皮細(xì)胞中的Drp1和mtROS增加；蛋白質(zhì)印跡分析顯示線粒體輸入受體亞基TOM20同源物、線粒體外膜標(biāo)記物減少，Drp1上調(diào)；共染色顯示間皮細(xì)胞層mtROS產(chǎn)生和Drp1表達(dá)增加；RNA測(cè)序顯示β-連環(huán)蛋白上調(diào)了多種衰老相關(guān)通路，并伴有線粒體裂變。這些結(jié)果表明β-連環(huán)蛋白誘導(dǎo)間皮細(xì)胞衰老和線粒體分裂，從而參與細(xì)胞衰老過程。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)β-連環(huán)蛋白促進(jìn)Drp1表達(dá)，誘導(dǎo)間皮細(xì)胞分泌TGF-β1，激活成纖維細(xì)胞中的Smad信號(hào)通路，導(dǎo)致肌成纖維細(xì)胞激活和腹膜纖維化。
圖1 β-連環(huán)蛋白觸發(fā)的線粒體分裂導(dǎo)致間皮細(xì)胞衰老
2. 敲除間皮細(xì)胞中的β-連環(huán)蛋白可改善PDF小鼠的間皮細(xì)胞衰老
為了進(jìn)一步研究β-連環(huán)蛋白在腹膜纖維化中的作用，作者使用AAV1-Cre-GFP構(gòu)建了β-連環(huán)蛋白敲除小鼠，發(fā)現(xiàn)PDF（腹膜透析液）處理小鼠會(huì)誘導(dǎo)mtROS產(chǎn)生，并導(dǎo)致Drp1和TGF-β1表達(dá)增加，但這些效應(yīng)在β-連環(huán)蛋白敲除小鼠中顯著減弱。此外PDF+AAV1-Ctrl組小鼠中發(fā)現(xiàn)Drp1和TGF-β1與β-連環(huán)蛋白強(qiáng)烈共定位，進(jìn)一步支持β-catenin-Drp1-TGF-β1軸在腹膜損傷中的關(guān)鍵作用。作者進(jìn)一步評(píng)估了細(xì)胞衰老標(biāo)志物p16INK4A和γH2AX的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其水平在β-連環(huán)蛋白敲除小鼠中顯著降低，在PDF處理小鼠中，p16INK4A和SA-β-gal陽(yáng)性細(xì)胞均顯著增加，但在β-連環(huán)蛋白敲除小鼠中顯著減少。這些結(jié)果證明β-連環(huán)蛋白在間皮細(xì)胞衰老中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，并且與線粒體裂變和TGF-β1分泌密切相關(guān)。
圖2 敲除間皮細(xì)胞中的β-連環(huán)蛋白可改善PDF小鼠的間皮細(xì)胞衰老
3. Senolytic 療法可改善腹膜纖維化
作者用達(dá)沙替尼和槲皮素(D+Q)治療PDF小鼠，發(fā)現(xiàn)PDF處理小鼠表現(xiàn)出明顯的衰老表型，其特征是SA-β-gal活性升高以及p16INK4A、p53和p21表達(dá)增加，D+Q治療顯著減少了細(xì)胞衰老的標(biāo)志物。組織學(xué)分析表明，D+Q治療減弱了PDF引起的腹膜厚度增加，蛋白質(zhì)印跡分析證實(shí)D+Q治療組中纖維化標(biāo)志物的表達(dá)受到抑制。作者還評(píng)估了D+Q對(duì)β-catenin-Drp1-TGF-β1信號(hào)軸的影響，發(fā)現(xiàn)D+Q治療有效抑制了β-連環(huán)蛋白、MMP-7、Drp1和TGF-β1表達(dá)的上調(diào)，同時(shí)保留了Tomm20的表達(dá)。免疫染色結(jié)果表明，D+Q治療小鼠的β-連環(huán)蛋白、mtROS產(chǎn)生、Drp1和TGF-β1/α-SMA的水平受到抑制，而E-鈣粘蛋白則得到恢復(fù)。這些結(jié)果表明，細(xì)胞衰老和β-catenin-Drp1-TGF-β1通路形成了一個(gè)相互循環(huán)，加速腹膜纖維化。
圖3 Senolytic 療法可改善腹膜纖維化
實(shí)驗(yàn)結(jié)論
本研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期腹膜透析患者的腹膜透析流出物和腹膜活檢中，衰老間皮細(xì)胞增多，并且衰老間皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞之間出現(xiàn)更多的通訊信號(hào)，并證明間皮細(xì)胞衰老強(qiáng)烈促進(jìn)腹膜纖維化。在機(jī)制上，β-catenin-Drp1-TGF-β1軸是腹膜纖維化發(fā)生和進(jìn)展的關(guān)鍵介質(zhì)。這為理解腹膜纖維化的機(jī)制提供了新的見解，并提供了腹膜纖維化治療的新策略。
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