近日，丹麥哥本哈根大學(xué)Elisabetta Ferretti團(tuán)隊(duì)以小鼠植入后外胚層（post-implantation epiblast）為模型，深入探究了細(xì)胞在響應(yīng)相同分化信號(hào)（如WNT、BMP）時(shí)的不同命運(yùn)（如神經(jīng)外胚層、內(nèi)胚層、中胚層）決定機(jī)制。研究利用外胚層干細(xì)胞（EpiSCs）體外培養(yǎng)模型，結(jié)合基因編輯、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序（WGBS）、染色質(zhì)免疫沉淀測(cè)序（ChIP-seq）和染色質(zhì)可及性分析（ATAC-seq）等多組學(xué)技術(shù)，系統(tǒng)解析了表觀遺傳修飾如何決定外胚層細(xì)胞分化命運(yùn)。相關(guān)研究成果以“Cell-context response to germ layer differentiation signals is predetermined by the epigenome in regionalized epiblast populations”發(fā)表在《Nature Communications》期刊。

研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF/ERK信號(hào)通路活性在外胚層細(xì)胞中呈現(xiàn)梯度分布，通過(guò)調(diào)控DNA甲基化（而非染色質(zhì)可及性）決定了神經(jīng)外胚層、定型內(nèi)胚層（Definitive Endoderm，DE）和神經(jīng)中胚層祖細(xì)胞（NMPs）的命運(yùn)偏倚，這種譜系偏倚在分化之前被“預(yù)編程”（primed）。DNA甲基化在WNT信號(hào)驅(qū)動(dòng)下調(diào)控胚層分化，而染色質(zhì)可及性則主要影響B(tài)MP信號(hào)介導(dǎo)的胚外中胚層（ExM）命運(yùn)決定。研究進(jìn)一步揭示轉(zhuǎn)錄因子PBX1通過(guò)調(diào)控ERK活性，進(jìn)而影響ETS家族轉(zhuǎn)錄因子。PBX1-ERK-ETS軸不依賴于HOX功能，通過(guò)調(diào)控Spry2反饋回路，在外胚層期即構(gòu)建譜系特異性表觀基因組狀態(tài)，從而決定細(xì)胞命運(yùn)。

英文標(biāo)題：Cell-context response to germ layer differentiation signals is predetermined by the epigenome in regionalized epiblast populations
中文標(biāo)題：區(qū)域化外胚層細(xì)胞群中，細(xì)胞對(duì)胚層分化信號(hào)的差異化響應(yīng)由表觀基因組預(yù)先決定
發(fā)表時(shí)間：2025年5月29日
發(fā)表期刊：Nature Communications
影響因子：IF15.7/Q1
技術(shù)平臺(tái)：WGBS、ChIP-seq、ATAC-seq、scRNA-seq
作者單位：丹麥哥本哈根大學(xué)
DOI:10.1038/s41467-025-60348-6

干細(xì)胞憑借其分化為多種細(xì)胞類(lèi)型的潛能，在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊前景。然而，干細(xì)胞維持多能性以及其向特定譜系進(jìn)行命運(yùn)特化的潛在分子機(jī)制仍未完全闡明。本研究利用體內(nèi)外模型，發(fā)現(xiàn)譜系特異性表觀遺傳印記（染色質(zhì)可及性和甲基化狀態(tài)）先于胚層分化程序轉(zhuǎn)錄激活，且主要通過(guò)DNA甲基化影響神經(jīng)外胚層、定型內(nèi)胚層（DE）和神經(jīng)中胚層譜系命運(yùn)決定�？傊�，本研究證明表觀遺傳機(jī)制可精細(xì)調(diào)控外胚層多能性，使其能夠?qū)Πl(fā)育譜系進(jìn)行時(shí)空特異性響應(yīng)。

研究方法
細(xì)胞模型：
使用小鼠外胚層干細(xì)胞（EpiSCs）作為植入后外胚層的體外模型。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)（FACS）分選出CLDN6High和CLDN6Low兩個(gè)亞群進(jìn)行研究。

遺傳與藥理學(xué)模型：
構(gòu)建Pbx1基因敲除（KO）的EpiSCs細(xì)胞系，用于研究PBX1功能。
使用ERK通路抑制劑（PD0325901,PD03）處理細(xì)胞，模擬低ERK活性狀態(tài)。

多組學(xué)綜合分析：

• RNA-seq：分析CLDN6High/Low EpiSCs、Pbx1KO EpiSCs及其分化后細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組差異。
• ATAC-seq：在全基因組范圍內(nèi)檢測(cè)染色質(zhì)開(kāi)放區(qū)域，揭示染色質(zhì)可及性狀態(tài)差異。
• 全基因組甲基化測(cè)序（WGBS）：在全基因組單堿基分辨率水平檢測(cè)DNA甲基化（5mC）模式，揭示DNA甲基化如何預(yù)先決定細(xì)胞命運(yùn)。
• ChIP-seq：在全基因組范圍內(nèi)鑒定PBX1蛋白的DNA結(jié)合位點(diǎn)，研究其直接調(diào)控的靶基因。

功能與表型分析：

• 免疫熒光（IF）與成像：對(duì)胚胎和細(xì)胞進(jìn)行染色，觀察譜系標(biāo)記物表達(dá)和組織形態(tài)。
• 流式細(xì)胞術(shù)與分選：基于CLDN6表達(dá)進(jìn)行細(xì)胞分選和表型分析。
• 電泳遷移率變動(dòng)分析（EMSA）：驗(yàn)證PBX1蛋白與Spry2基因調(diào)控區(qū)域的直接結(jié)合。
• 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析（STRING）：構(gòu)建并分析ERK/ETS與表觀遺傳調(diào)控蛋白之間的互作網(wǎng)絡(luò)。

圖1：具有前部和遠(yuǎn)端后部外胚層特性的區(qū)域化外胚層干細(xì)胞中的FGF/ERK差異性活性

圖2：CLDN6Low和CLDN6High外胚層干細(xì)胞具有顯著胚層分化偏倚差異

（3）外胚層DNA甲基化預(yù)先決定WNT驅(qū)動(dòng)的胚層命運(yùn)
為探究表觀遺傳機(jī)制，研究者首先對(duì)CLDN6分選細(xì)胞進(jìn)行ATAC-seq分析。出乎意料的是，在WNT抑制狀態(tài)下，CLDN6High與CLDN6Low EpiSCs之間僅鑒定出110個(gè)差異可及性peaks（DAPs），且無(wú)任何DAPs與胚層譜系基因直接相關(guān)（圖3a）。這一結(jié)果與之前報(bào)道的WNT信號(hào)驅(qū)動(dòng)染色質(zhì)異質(zhì)性結(jié)論相悖，提示在EpiSCs維持條件下，染色質(zhì)可及性并非命運(yùn)偏向的主要決定因子。但WNT刺激后，CLDN6Low APSD中NMPs特異性順式調(diào)控元件（CREs）可及性顯著增加，伴隨WNT效應(yīng)因子LEF1結(jié)合增強(qiáng)（圖3b），表明染色質(zhì)重塑是WNT響應(yīng)的下游事件而非預(yù)編程機(jī)制。

WGBS分析揭示決定性差異。盡管整體CpG甲基化水平無(wú)顯著差異（~70%），CLDN6Low EpiSCs的內(nèi)含子區(qū)域甲基化程度顯著高于CLDN6High細(xì)胞（圖3c-d）。更關(guān)鍵的是，差異甲基化基因（DMGs）分析發(fā)現(xiàn)，CLDN6Low與CLDN6High EpiSCs中，DE譜系基因（Foxa2, Gata6, Sox17）和神經(jīng)外胚層基因（Pax6, Onecut1/2, Lmx1a, Dbx1）表現(xiàn)出高甲基化，而NMPs相關(guān)基因則無(wú)差異甲基化（圖3e）。

以Pax6為例，其CRE區(qū)域在CLDN6High EpiSCs中特異低甲基化，與后續(xù)神經(jīng)分化中Pax6表達(dá)上調(diào)相關(guān)（圖3f），但ATAC-seq顯示該CRE在兩組EpiSCs中可及性類(lèi)似，證明DNA甲基化狀態(tài)先于染色質(zhì)開(kāi)放狀態(tài)決定譜系功能。WNT誘導(dǎo)的CLDN6Low APSD分化伴隨Pax6等區(qū)域甲基化水平下降（圖3d），而CLDN6High APSD中DE基因甲基化狀態(tài)保持穩(wěn)定。

上述研究結(jié)果表明，DNA甲基化預(yù)先決定WNT響應(yīng)機(jī)制，遠(yuǎn)端后部外胚層（CLDN6Low）通過(guò)高甲基化鎖定DE和前神經(jīng)命運(yùn)，介導(dǎo)WNT信號(hào)驅(qū)動(dòng)NMPs形成；而前部外胚層（CLDN6High）甲基化狀態(tài)允許WNT誘導(dǎo)DE分化（圖3g）。

圖3：外胚層甲基化組預(yù)先決定胚層分化過(guò)程中細(xì)胞的WNT響應(yīng)

1. ATAC-seq數(shù)據(jù)火山圖顯示與CLDN6Low外胚層干細(xì)胞相比，CLDN6High外胚層干細(xì)胞中有110個(gè)唯一差異可及性峰（DAPs）。
2. CLDN6Low和CLDN6High外胚層干細(xì)胞及APSD在神經(jīng)（前部和后部）與體節(jié)前中胚層（PSM）假定順式調(diào)控元件（CREs）上的染色質(zhì)可及性位點(diǎn)的平均密度圖（上圖）和熱圖（下圖）。
3. 豆莢圖顯示CLDN6Low和CLDN6High外胚層干細(xì)胞及APSD中基因±5 kb的CpG甲基化水平相似。
4. 星戰(zhàn)圖顯示內(nèi)含子CpG甲基化水平，CLDN6Low外胚層干細(xì)胞中最高，CLDN6High APSD中最低。CLDN6High外胚層干細(xì)胞與APSD水平相似。
5. 圓形代表CLDN6Low和CLDN6High外胚層干細(xì)胞各個(gè)細(xì)胞類(lèi)型中的所有基因。重疊區(qū)域顯示這兩種細(xì)胞類(lèi)型之間的差異甲基化基因（DMGs），包括高甲基化和低甲基化基因。CLDN6Low和CLDN6High外胚層干細(xì)胞具有與定型內(nèi)胚層DE（Foxa2, Sox17, Gsc, Gata6）、神經(jīng)外胚層（Pax6, Onecut1, Onecut2, Lmx1a, Dbx1）譜系相關(guān)的DMGs，但無(wú)神經(jīng)中胚層祖細(xì)胞NMPs相關(guān)基因。
6. Pax6基因組區(qū)域的WGBS可視化顯示CLDN6High外胚層干細(xì)胞中特異高甲基化區(qū)域（紅色箭頭），相較CLDN6Low外胚層干細(xì)胞（白色箭頭），位置和功能與先前研究PAX6 CRE41相似。
7. 模式圖展示DNA甲基化如何預(yù)先設(shè)定植入后外胚層細(xì)胞對(duì)WNT依賴性和非依賴性譜系命運(yùn)的響應(yīng)。

圖4：PBX1調(diào)控外胚層干細(xì)胞中的ERK水平與表觀遺傳機(jī)制。

1. 對(duì)植入后E5.5胚胎進(jìn)行的共聚焦免疫熒光分析，顯示PBX1在外胚層（Ep）中表達(dá)，而在原始內(nèi)胚層（PrEnd）中不表達(dá)。
2. 野生型（WT）與Pbx1敲除（Pbx1KO）外胚層干細(xì)胞中差異表達(dá)基因的熱圖，揭示了FGF/ERK信號(hào)通路組分的差異。
3. Western blot證實(shí)PBX1敲除外胚層干細(xì)胞中PBX1缺失和磷酸化ERK1/2（pERK1/2）水平降低。
4. 染色質(zhì)可及性數(shù)據(jù)火山圖顯示Pbx1敲除外胚層干細(xì)胞中的576個(gè)差異可及性峰（DAPs），并顯示BMP響應(yīng)基因（Hand1, E2f4, Col26a1, Bmp3, Egr3, Itga4）富集。
5. 野生型與Pbx1敲除外胚層干細(xì)胞input DAPs的de novo motif分析餅圖，揭示ETS結(jié)合位點(diǎn)富集。
6. 野生型相對(duì)于Pbx1敲除外胚層干細(xì)胞的576個(gè)DAPs富集ETS轉(zhuǎn)錄因子motif。
7. 各細(xì)胞類(lèi)型（野生型和Pbx1敲除型）圓圈圖。重疊區(qū)域?qū)��?yīng)差異甲基化基因（DMGs）。
8. STRING蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析顯示ERK/ETS蛋白與表觀遺傳機(jī)制之間的互作。
9. PBX1負(fù)調(diào)控ERK反饋環(huán)路從而調(diào)節(jié)ERK信號(hào)活性機(jī)制示意圖。

圖5：ERK缺失型Pbx1敲除外胚層干細(xì)胞在分化相關(guān)的胚外中胚層缺失出現(xiàn)前，已在胚外中胚層譜系基因上表現(xiàn)出特異性染色質(zhì)和DNA甲基化譜。

1. 受BMP信號(hào)影響的E7.5時(shí)期胚外中胚層譜系：尿囊、羊膜和卵黃囊。
2. E7.5對(duì)照組和Pbx1f/f;Pbx2;Sox2-/-Cre/+胚胎的共聚焦三維投影圖。
3. 野生型和Pbx1敲除外胚層干細(xì)胞向PPS和ExM細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)方案示意圖。
4. 不同階段（黃色:外胚層干細(xì)胞，灰色:PPS，紅色:ExM）的譜系特異性差異表達(dá)基因（DEDG）熱圖。
5. Pbx1敲除外胚層干細(xì)胞在進(jìn)行胚外中胚層分化時(shí)，表現(xiàn)出向原始紅細(xì)胞和卵黃囊間充質(zhì)分化偏好。
6. 野生型與Pbx1敲除外胚層干細(xì)胞中的差異甲基化基因（DMGs）及其在PPS和ExM分化過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄變化示意圖。
7. WGBS可視化圖，顯示野生型和Pbx1敲除外胚層干細(xì)胞中Hand1位點(diǎn)差異甲基化區(qū)域，表明Pbx1敲除細(xì)胞中存在高甲基化。條形圖顯示CpG甲基化水平。
8. Hand1位點(diǎn)的UCSC基因組瀏覽器視圖，顯示在野生型條件下染色質(zhì)可及性增加，而在Pbx1敲除細(xì)胞中該位點(diǎn)保持關(guān)閉狀態(tài)。
9. WGBS軌跡圖，顯示野生型和Pbx1敲除外胚層干細(xì)胞中Tbx3位點(diǎn)的CpG甲基化水平，表明野生型外胚層干細(xì)胞中存在高甲基化。底部條形圖描繪CpG甲基化水平。
10. Tbx3位點(diǎn)ATAC-seq軌跡圖顯示Pbx1敲除細(xì)胞與野生型細(xì)胞相比，染色質(zhì)可及性增加。