一、引言
肝細(xì)胞癌是全球范圍內(nèi)致死率位列第三的惡性腫瘤，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，與腫瘤微環(huán)境的高度異質(zhì)性密切相關(guān)。近年來，以單細(xì)胞RNA測序和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)為代表的高通量技術(shù)，為深入解析肝臟生理、病理狀態(tài)下的細(xì)胞多樣性、空間結(jié)構(gòu)及互作網(wǎng)絡(luò)提供了革命性工具。本文在總結(jié)該領(lǐng)域最新進(jìn)展的基礎(chǔ)上，系統(tǒng)梳理了單細(xì)胞與空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)在肝臟發(fā)育、功能分區(qū)、疾病機(jī)制以及腫瘤異質(zhì)性研究中的應(yīng)用，并對技術(shù)整合的未來方向進(jìn)行展望。

scRNA-seq工作流程的主要步驟和最常用技術(shù)的比較

單細(xì)胞RNA測序分析研究肝臟病理生理  

二、單細(xì)胞RNA測序揭示肝細(xì)胞癌干細(xì)胞的分子與功能異質(zhì)性
原文信息
英文標(biāo)題：Single cell analysis reveals cancer stem cell heterogeneity in hepatocellular carcinoma
發(fā)表雜志：Hepatology, 2018
影響因子：14.079
實驗材料：流式分選HuH1/HuH7細(xì)胞系肝細(xì)胞群體；分選肝腫瘤細(xì)胞P1
實驗方法：免疫熒光染色、流式分選、Smart-seq、10x Genomics scRNA-seq

研究背景
肝細(xì)胞癌的腫瘤內(nèi)異質(zhì)性在一定程度上源于肝癌干細(xì)胞的持續(xù)存在。然而，由于不同細(xì)胞表面標(biāo)志物所定義的肝癌干細(xì)胞群體在致癌驅(qū)動機(jī)制上可能存在差異，這為明確其分子靶向治療策略帶來了挑戰(zhàn)。本研究基于10x Genomics單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序平臺，對分選的HuH1/HuH7細(xì)胞系以及肝腫瘤組織樣本（P1）中的細(xì)胞進(jìn)行高分辨率轉(zhuǎn)錄組分析，并結(jié)合免疫熒光染色與流式分選技術(shù)，在單細(xì)胞水平整合轉(zhuǎn)錄組學(xué)與功能學(xué)數(shù)據(jù)，系統(tǒng)評估肝癌干細(xì)胞的異質(zhì)性程度。

研究內(nèi)容與結(jié)論
研究結(jié)果表明，肝癌干細(xì)胞在單細(xì)胞層面存在顯著的表型、功能及轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性。不同肝癌干細(xì)胞亞群具備獨立的分子特征，且其差異表達(dá)的基因與肝癌患者預(yù)后密切相關(guān)，提示這些亞群在推動腫瘤內(nèi)異質(zhì)性及疾病進(jìn)展中具有重要作用。本研究為深入理解肝癌干細(xì)胞亞群的多樣性提供了新的視角，其揭示的分子異質(zhì)性進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了該類細(xì)胞在腫瘤異質(zhì)性形成、預(yù)后判斷及靶向治療中的關(guān)鍵意義。

10x肝實質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄圖譜  

三、基于多組織單細(xì)胞測序的肝細(xì)胞癌免疫微環(huán)境動態(tài)圖譜
原文信息
英文標(biāo)題：Landscape and Dynamics of Single Immune Cells in Hepatocellular Carcinoma
發(fā)表雜志：Cell, 2019
影響因子：38.637
實驗材料：16例肝細(xì)胞癌患者（男13例，女3例），分選自腫瘤、癌旁肝、淋巴結(jié)、外周血及腹水的CD45+細(xì)胞
實驗方法：scRNA-seq（10x Genomics）、Smart-seq2、流式分選

研究背景
在腫瘤免疫學(xué)研究中，癌旁組織與外周血常被用作主要對照，而對其他與免疫密切相關(guān)的組織或病理部位（如腹水）的關(guān)注則相對不足。腹水作為肝細(xì)胞癌患者常見的病理產(chǎn)物，其形成往往與不良預(yù)后相關(guān)，但其中免疫細(xì)胞的組成特性及其與肝癌發(fā)展的關(guān)聯(lián)尚未被充分闡明。為系統(tǒng)解析肝癌的免疫微環(huán)境，本研究從16例肝細(xì)胞癌患者中，獲取了包括腫瘤組織、癌旁肝組織、引流淋巴結(jié)、外周血以及腹水在內(nèi)的五類樣本，并分選出CD45+免疫細(xì)胞進(jìn)行高分辨率單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，旨在全面描繪肝癌免疫細(xì)胞類型、分子表達(dá)特征，以及不同組織間免疫細(xì)胞的動態(tài)分布與功能聯(lián)系。

研究結(jié)論
研究發(fā)現(xiàn)，LAMP3+樹突狀細(xì)胞可能代表一類成熟態(tài)的傳統(tǒng)樹突狀細(xì)胞，具備從腫瘤組織向淋巴結(jié)遷移的潛在能力。該細(xì)胞亞群表達(dá)多種免疫調(diào)控相關(guān)配體，顯示出調(diào)節(jié)不同淋巴細(xì)胞亞群功能的潛力。在腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞中，存在具有不同轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的亞群，其中特定TAM群體與患者不良預(yù)后顯著相關(guān)，并提示SLC40A1與GPNMB基因可能參與其炎癥調(diào)控功能。此外，研究證實腹水中的髓系細(xì)胞和淋巴細(xì)胞分別主要來源于腫瘤局部和血液循環(huán)。本研究所揭示的CD45+免疫細(xì)胞在多組織間的動態(tài)分布與功能異質(zhì)性，為深入理解肝細(xì)胞癌的免疫景觀增添了新的維度。

肝癌中CD45 +免疫細(xì)胞的景觀  

四、單細(xì)胞與空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)在肝臟生理病理及細(xì)胞互作研究中的新進(jìn)展
原文信息
英文標(biāo)題：Single-cell genomics and spatial transcriptomics: Discovery of novel cell states and cellular interactions in liver physiology and disease biology
發(fā)表雜志：Hepatology 2020
影響因子：20.582

研究結(jié)論
單細(xì)胞RNA測序的早期重要應(yīng)用之一是研究小鼠與人類肝臟的組織分區(qū)。然而，該技術(shù)在應(yīng)用于肝臟生理學(xué)研究時面臨的主要挑戰(zhàn)，是如何將單細(xì)胞水平RNA數(shù)據(jù)與其在組織中的空間位置信息相整合。為此，目前已開發(fā)出多種針對性的測序策略與生物信息學(xué)分析方法，從而推動了對肝臟分區(qū)的全新認(rèn)識。例如，通過結(jié)合單細(xì)胞RNA測序與單分子RNA熒光原位雜交技術(shù)，研究者實現(xiàn)了對小鼠肝臟分區(qū)的高分辨率空間轉(zhuǎn)錄組分析。相關(guān)進(jìn)展表明，不僅可從單細(xì)胞數(shù)據(jù)中推斷空間分布信息，也可通過原位空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)精確鑒定肝細(xì)胞與肝竇內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞類型在肝臟中的區(qū)域化分布特征。

此外，單細(xì)胞RNA測序技術(shù)也成功應(yīng)用于：鑒定肝臟發(fā)育與再生過程中的祖細(xì)胞群；描繪慢性肝病與肝硬化階段非實質(zhì)細(xì)胞的表型變化；闡明肝癌上皮細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境間的相互作用機(jī)制；以及揭示肝細(xì)胞癌內(nèi)部腫瘤微環(huán)境的異質(zhì)性。這些研究拓展了對肝臟生理與病理狀態(tài)下細(xì)胞狀態(tài)多樣性及細(xì)胞間通訊網(wǎng)絡(luò)的理解。

scRNA-seq了解肝細(xì)胞癌的腫瘤微環(huán)境  

五、基于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)解析肝臟實質(zhì)與非實質(zhì)細(xì)胞譜系的早期發(fā)育軌跡
原文信息
英文標(biāo)題：Single-cell transcriptomics reveals early emergence of liver parenchymal and non-parenchymal cell lineages
發(fā)表雜志：Cell 2020
影響因子：38.637
實驗材料：小鼠胚胎15個樣本，涵蓋E7.5（內(nèi)胚層祖細(xì)胞）、E8.75（內(nèi)胚層腸管道）、E9.5（肝內(nèi)胚層）及E10.5（肝內(nèi)胚層）四個發(fā)育階段
實驗方法：scRNA-seq（10x Genomics）、流式分選、免疫熒光

研究背景
肝臟作為一高度復(fù)雜的多功能器官，其構(gòu)成細(xì)胞來源于內(nèi)胚層及中胚層。目前，對于這些細(xì)胞如何在發(fā)育過程中有序組織并形成功能必需的多種實質(zhì)細(xì)胞與非實質(zhì)細(xì)胞，以及它們?nèi)绾螐母髯宰婕?xì)胞起源、并在肝臟形成過程中產(chǎn)生相互作用，仍缺乏系統(tǒng)性認(rèn)識。這一知識缺口限制了對肝臟發(fā)育機(jī)制的深入理解。

研究內(nèi)容與結(jié)論
本研究通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，對小鼠胚胎從E7.5至E10.5四個關(guān)鍵發(fā)育時期的15個樣本進(jìn)行分析，系統(tǒng)解析了肝臟細(xì)胞譜系的早期分化過程。研究發(fā)現(xiàn)，在肝臟發(fā)育早期，內(nèi)皮細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞及肝細(xì)胞已呈現(xiàn)出明顯的多樣性，并進(jìn)一步構(gòu)建了完整的內(nèi)皮細(xì)胞與肝細(xì)胞譜系的發(fā)育時間圖譜。該研究為理解肝臟從內(nèi)胚層和中胚層起源逐步建立細(xì)胞譜系的過程提供了全面、高分辨率的單細(xì)胞發(fā)育圖譜，揭示了肝實質(zhì)與非實質(zhì)細(xì)胞譜系在胚胎早期的動態(tài)出現(xiàn)與分化軌跡。

scRNA-seq顯示小鼠內(nèi)胚層和中胚層肝細(xì)胞譜系  

六、總結(jié)
在多細(xì)胞器官如肝臟中，組織穩(wěn)態(tài)依賴于不同細(xì)胞類型間精細(xì)協(xié)調(diào)的相互作用。單細(xì)胞技術(shù)雖能揭示分子異質(zhì)性，但缺乏空間背景則難以闡明細(xì)胞群體如何協(xié)同調(diào)控組織功能。通過整合空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)、單細(xì)胞基因表達(dá)及染色質(zhì)可及性數(shù)據(jù)，可以構(gòu)建高分辨率的多組學(xué)圖譜，揭示細(xì)胞譜系與特定功能區(qū)域（如損傷、修復(fù)與重塑區(qū)）的關(guān)聯(lián)，這是在傳統(tǒng)單細(xì)胞分析中難以實現(xiàn)的。

綜上所述，結(jié)合空間與單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組策略，顯著提升了在轉(zhuǎn)錄組與表觀基因組層面對肝臟細(xì)胞組成和功能的空間解析能力。這些技術(shù)為系統(tǒng)描繪肝臟生理與病理狀態(tài)下的細(xì)胞圖譜、解析疾病機(jī)制、發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)志物與治療靶點提供了強(qiáng)大的工具與框架，并將持續(xù)推動肝臟生物學(xué)研究與精準(zhǔn)醫(yī)療的發(fā)展。

樂備實（上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司旗下全資子公司），是國內(nèi)專注于提供高質(zhì)量蛋白檢測以及組學(xué)分析服務(wù)的實驗服務(wù)專家，自2018年成立以來，樂備實不斷尋求突破，公司的服務(wù)技術(shù)平臺已擴(kuò)展到單細(xì)胞測序、空間多組學(xué)、流式檢測、超敏電化學(xué)發(fā)光、Luminex多因子檢測、抗體芯片、PCR Array、ELISA、Elispot、PLA蛋白互作、多色免疫組化、DSP空間多組學(xué)等30多個，建立起了一套涵蓋基因、蛋白、細(xì)胞以及組織水平實驗的完整檢測體系