蛋白互作五種常見(jiàn)技術(shù)及操作步驟
- 不同技術(shù)的功能定位存在差異：部分技術(shù)適用于靶蛋白篩選（如酵母雙雜交 Y2H），部分適用于互作驗(yàn)證（如鄰近連接技術(shù) PLA），還有部分兼具篩選與驗(yàn)證雙重功能（如免疫共沉淀 Co-IP 聯(lián)用蛋白質(zhì)譜可實(shí)現(xiàn)篩選，聯(lián)用 WB 則可完成驗(yàn)證）。因此，篩選類技術(shù)一般用于預(yù)實(shí)驗(yàn)階段的靶點(diǎn)確定，驗(yàn)證類技術(shù)多用于明確具體分子后的功能驗(yàn)證。
- 上述技術(shù)可分為細(xì)胞體系與非細(xì)胞體系（In tube）兩類：細(xì)胞體系技術(shù)更貼合生理研究背景，但易受多種干預(yù)因素影響；非細(xì)胞體系技術(shù)更易驗(yàn)證蛋白間直接互作，但難以完全還原體內(nèi)真實(shí)場(chǎng)景，且對(duì)蛋白純化操作要求更高。為確保研究結(jié)論的嚴(yán)謹(jǐn)性，蛋白 - 蛋白互作驗(yàn)證需同時(shí)結(jié)合細(xì)胞與非細(xì)胞體系開展。
- 上述技術(shù)在國(guó)自然項(xiàng)目設(shè)計(jì)中存在 “必備項(xiàng)” 與 “加分項(xiàng)” 之分（觀點(diǎn)僅供參考），無(wú)需在方案中全面羅列，應(yīng)結(jié)合研究需求合理選擇。
一、酵母雙雜交系統(tǒng)（Yeast Two-Hybrid System，Y2H）
- 構(gòu)建融合蛋白：將目標(biāo)蛋白（蛋白 X）與 BD 融合形成 “誘餌”，將待篩蛋白（蛋白 Y）與 AD 融合形成 “獵物”。
- 轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞：將編碼兩種融合蛋白的基因分別導(dǎo)入酵母細(xì)胞。
- 互作介導(dǎo)重組：若蛋白 X 與蛋白 Y 在酵母細(xì)胞內(nèi)發(fā)生互作，其融合蛋白可使 BD 與 AD 靠近，重組為活性轉(zhuǎn)錄激活因子。
- 結(jié)果判定：活性轉(zhuǎn)錄激活因子會(huì)驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因（如 HIS3、lacZ 等）表達(dá)，通過(guò)檢測(cè)報(bào)告基因活性即可判斷蛋白間是否存在互作。
二、免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation, Co-IP）
兼具靶蛋白篩選與蛋白 - 蛋白互作驗(yàn)證功能（國(guó)自然必需技術(shù)），免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation, Co-IP）以抗體與抗原的特異性結(jié)合為核心原理，用于解析蛋白間相互作用。細(xì)胞在非變性條件下裂解時(shí)，蛋白間的生理性互作狀態(tài)可得以保留，利用靶蛋白特異性抗體進(jìn)行沉淀時(shí)，與之結(jié)合的互作蛋白會(huì)隨靶蛋白共同被捕獲。
- 細(xì)胞處理：收集細(xì)胞并進(jìn)行裂解，裂解液中需添加蛋白酶抑制劑以抑制蛋白降解。
- 上清獲�。杭�(xì)胞裂解后離心去除沉淀的細(xì)胞碎片，收集含可溶性蛋白的上清液。
- 免疫結(jié)合：加入靶蛋白特異性抗體及蛋白 A/G 偶聯(lián)磁珠（或瓊脂糖珠），于 4°C 孵育以實(shí)現(xiàn)抗體與靶蛋白的特異性結(jié)合。
- 復(fù)合物捕獲：孵育結(jié)束后離心收集結(jié)合有蛋白復(fù)合物的珠子，棄去未結(jié)合的游離蛋白。
- 非特異洗脫：用裂解緩沖液多次洗滌珠子，去除非特異性結(jié)合的雜蛋白。
- 復(fù)合物釋放：加入蛋白樣品緩沖液并煮沸珠子，使結(jié)合的蛋白復(fù)合物從抗體 - 珠子復(fù)合物上釋放。
- 結(jié)果分析：通過(guò) SDS-PAGE 電泳分離蛋白復(fù)合物，再結(jié)合 Western blotting（驗(yàn)證已知互作蛋白）或質(zhì)譜分析（篩選未知互作蛋白）進(jìn)行結(jié)果解讀。
三、GST 下拉實(shí)驗(yàn)（GST pull-down）
- 構(gòu)建攜帶 GST 標(biāo)簽的融合蛋白表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染至原核或真核表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行蛋白表達(dá)。
- 收集表達(dá)菌株或細(xì)胞并完成裂解操作，裂解液中需添加蛋白酶抑制劑以防止目標(biāo)蛋白降解。
- 將細(xì)胞裂解物與固化有 GST 標(biāo)簽蛋白或 GST 融合蛋白的瓊脂糖珠充分混合，置于 4℃條件下孵育數(shù)小時(shí)。
- 離心收集結(jié)合蛋白復(fù)合物的瓊脂糖珠，棄去未發(fā)生結(jié)合的游離蛋白組分。
- 選用適配緩沖液對(duì)瓊脂糖珠進(jìn)行多次洗滌，去除非特異性結(jié)合的雜蛋白。
- 向沉淀的瓊脂糖珠中加入蛋白樣品緩沖液并煮沸，洗脫結(jié)合的蛋白復(fù)合物。
- 通過(guò) SDS-PAGE 電泳對(duì)洗脫的蛋白復(fù)合物進(jìn)行分離，結(jié)合 Western blot 技術(shù)驗(yàn)證已知互作蛋白，或借助質(zhì)譜分析篩選未知互作蛋白。
四、免疫熒光共定位（ImmunoFluorescence Colocalization）
- 構(gòu)建目標(biāo)蛋白與不同熒光蛋白的融合表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染至宿主細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)蛋白表達(dá)。
- 待細(xì)胞培養(yǎng)至適宜密度后，采用固定液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定處理，維持細(xì)胞形態(tài)與蛋白定位。
- 依據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，選用特異性熒光抗體對(duì)靶蛋白進(jìn)行免疫標(biāo)記（若為熒光蛋白融合表達(dá)則可省略此步）。
- 利用激光共聚焦顯微鏡對(duì)細(xì)胞進(jìn)行成像觀察，采集熒光信號(hào)圖像。
- 運(yùn)用圖像分析軟件處理采集到的圖像，計(jì)算共定位系數(shù)，對(duì)兩種蛋白的共定位程度進(jìn)行定量評(píng)估。
五、鄰近連接技術(shù)（Proximity Ligation Assay，PLA）
- 樣本制備：對(duì)細(xì)胞或組織樣本進(jìn)行固定及透化處理，確保探針可有效結(jié)合靶蛋白。
- 封閉處理：對(duì)樣本進(jìn)行封閉以阻斷非特異性結(jié)合位點(diǎn)，降低背景干擾。
- 一抗孵育：加入兩種特異性一抗，分別與兩種靶蛋白的不同表位特異性結(jié)合。
- PLA 探針?lè)跤杭尤雰煞N PLA 探針（帶寡核苷酸標(biāo)簽的二抗），使其與對(duì)應(yīng)的一抗特異性結(jié)合。
- 連接反應(yīng)：若兩種靶蛋白存在互作，結(jié)合的 PLA 探針會(huì)充分靠近，此時(shí)連接酶可將探針上的寡核苷酸連接，形成環(huán)狀 DNA 模板。
- 滾環(huán)擴(kuò)增：采用 RCA 技術(shù)對(duì)環(huán)狀 DNA 模板進(jìn)行擴(kuò)增，生成大量串聯(lián)重復(fù)的 DNA 產(chǎn)物，實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大。
- 檢測(cè)分析：加入熒光標(biāo)記的探針與擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合，通過(guò)熒光顯微鏡觀察熒光信號(hào)，同時(shí)完成定性判斷與定量分析。
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| LXR-PLA | PLA可視化蛋白互作試劑盒 |
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