2025年8月8日，生殖醫(yī)學(xué)與子代健康全國重點實驗室、南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院黃伯賢教授團隊通過整合RNA-Bisulfite測序（RNA-BS）、轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）、染色質(zhì)可及性測序（ATAC-seq）和CUT&Tag測序等多組學(xué)技術(shù)，首次系統(tǒng)構(gòu)建了妊娠早期（9-12周）人類七種主要胎兒組織（腦、心、肝、肺、腎、肌肉和胃）的mRNA m5C（5-甲基胞嘧啶）修飾圖譜。研究發(fā)現(xiàn)m5C修飾在胎兒發(fā)育過程中呈現(xiàn)顯著的組織和階段特異性動態(tài)變化，其中腦組織表現(xiàn)出最高豐度的m5C修飾水平，并與基因表達穩(wěn)態(tài)、可變剪切等關(guān)鍵發(fā)育過程正相關(guān)。相關(guān)研究成果以“RNA-m5C regulatory atlas of human fetal tissues uncover the activities of Nsun2/Jarid2/Alyref axis“為題發(fā)表于《Journal of Advanced Research》(JAR)。

英文標題：RNA-m5C regulatory atlas of human fetal tissues uncover the activities of Nsun2/Jarid2/Alyref axis
中文標題：人類胎兒組織的RNA m5C調(diào)控圖譜揭示了Nsun2/Jarid2/Alyref軸活性
發(fā)表時間：2025-8-8
發(fā)表期刊：Journal of Advanced Research
影響因子：IF13/Q1
技術(shù)平臺：RNA-Bis-seq、RNA-seq、ATAC-seq、CUT&Tag
作者單位：南京醫(yī)科大學(xué)姑蘇學(xué)院
DOI:10.1016/j.jare.2025.08.004

m5C是一種對胎兒發(fā)育至關(guān)重要的RNA修飾，但其在不同組織中的特異性分布及調(diào)控機制尚未闡明。

本研究旨在構(gòu)建人類胎兒組織m5C分布的高分辨率組織特異性圖譜，并解析RNA甲基化與表觀遺傳調(diào)控互作。研究對七種不同的人類胎兒組織同時進行了m5C甲基化分析（RNA-BS）和轉(zhuǎn)錄組分析（RNA-seq），結(jié)合斑點印跡實驗（Dot Blot）、免疫熒光顯微鏡、免疫共沉淀（Co-IP）、CUT&Tag和ATAC-Seq等多種實驗方法，以研究Nsun2介導(dǎo)的m5C修飾影響胎兒發(fā)育過程中的染色質(zhì)可及性狀態(tài)和組蛋白修飾模式。

研究在建立首個人類胎兒組織m5C修飾的綜合圖譜并揭示其組織特異性甲基化模式的基礎(chǔ)上，進一步證實m5C修飾的轉(zhuǎn)錄本主要通過可變剪切維持基因表達穩(wěn)態(tài)，并調(diào)控關(guān)鍵發(fā)育轉(zhuǎn)錄機制。具體而言，研究者發(fā)現(xiàn)Nsun2先招募Jarid2/Ezh2復(fù)合體，后通過Alyref以m5C依賴性方式調(diào)控其活性，從而協(xié)調(diào)組蛋白修飾和染色質(zhì)可及性，支持正常的胎兒發(fā)育。

本研究構(gòu)建了一個單堿基分辨率、基本覆蓋人類胎兒發(fā)育期的不同組織特異性m5C圖譜，可作為發(fā)育表觀遺傳學(xué)研究的重要資源。此外，研究者發(fā)現(xiàn)Nsun2/Jarid2/Alyref通路軸整合RNA甲基化、組蛋白修飾和染色質(zhì)可及性，以精確調(diào)控胎兒發(fā)育，深化對表觀遺傳調(diào)控的理解，并為發(fā)育障礙的潛在治療靶點提供了新見解。

研究摘要

研究方法
（1）動物模型
Nsun2條件性敲除小鼠模型：使用Nestin-Cre驅(qū)動在神經(jīng)前體細胞中特異性敲除Nsun2，研究其對胎兒大腦發(fā)育的影響。
Nsun5全身性敲除小鼠模型：用于對比研究另一m5C甲基轉(zhuǎn)移酶的功能。
人神經(jīng)前體細胞（hNPC）模型：構(gòu)建Nsun2敲低（KD）、Alyref過表達（OE）及Nsun2催化位點突變（Mut，C271A/C321A）的細胞系，進行體外機制驗證和挽救實驗。

（2）多組學(xué)測序技術(shù)：
RNA-BS(RNA-Bis-seq)：對21個胎兒組織樣本（7種組織×3個生物學(xué)重復(fù)）進行了m5C甲基化測序，在全轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)單堿基分辨率地精確鑒定m5C修飾位點。
RNA-seq：對相同的21個樣本進行轉(zhuǎn)錄組測序，分析基因表達水平并與m5C修飾數(shù)據(jù)進行關(guān)聯(lián)分析。
ATAC-seq：在Nsun2條件性敲除小鼠模型中評估染色質(zhì)可及性，揭示染色質(zhì)開放區(qū)域變化。
CUT&Tag：研究組蛋白修飾（H3K27me3, H3K27ac）在基因組上的定位和富集情況。

（3）分子與細胞生物學(xué)實驗：
IF：檢測神經(jīng)元標記物（NeuN, Tuj1, Map2, Satb2等）、增殖/凋亡標記物、組蛋白修飾等表達與定位。
Western Blot和Dot Blot：定量檢測蛋白表達水平及整體m5C修飾水平。
Co-IP：驗證Nsun2、Ezh2、Jarid2、Alyref等蛋白之間的直接互作。
mRNA穩(wěn)定性實驗：使用轉(zhuǎn)錄抑制劑放線菌素D（Act-D）處理，檢測EZH2和JARID2 mRNA半衰期。

結(jié)果圖形
（1）胎兒主要組織類型中的m5C特征
本研究首先對妊娠早期（9-12周）的9個胎兒共21個樣本（7種組織各3個重復(fù)）進行了RNA-BS分析（圖1A）。相關(guān)熱圖分析顯示，不同組織間的m5C甲基化水平具有聚類特征，表明m5C修飾具有組織特異性（圖1B）。韋恩圖分析進一步揭示，大多數(shù)m5C修飾位點是組織特異性的，例如大腦中59%的位點和心臟中38%的位點是該組織獨有的（圖1C）。在所有檢測的組織中，胎兒大腦的整體m5C水平顯著高于其他組織（圖1D）。

研究在全基因組范圍內(nèi)共鑒定出3,460-16,137個m5C位點，分布于1,615-4,299個mRNA上（Fig. 1E-F），其中大部分位于內(nèi)含子和外顯子區(qū)域（大腦中分別占35.9%和29.6%）（圖1G）。有趣的是，21個樣本共鑒定出2,624個m5C轉(zhuǎn)錄本，其中845個為未在m5C-Atlas數(shù)據(jù)庫中注釋的新轉(zhuǎn)錄本，腦組織中這一比例高達54.91%（Fig. 1H），GO分析顯示這些新轉(zhuǎn)錄本富集于組織分化、線粒體基因表達和非編碼RNA轉(zhuǎn)錄等過程。

圖1：胎兒組織樣本的m5C甲基化譜

（2）m5C修飾的轉(zhuǎn)錄本與胎兒組織基因表達穩(wěn)態(tài)正相關(guān)
為深入解析m5C修飾對基因表達穩(wěn)態(tài)的調(diào)控作用，研究通過整合m5C-Seq和RNA-seq數(shù)據(jù)，將m5C修飾轉(zhuǎn)錄本按甲基化水平分為低（L）、中（M）、高（H）三組（圖2A）。結(jié)果顯示，組織特異性越強的轉(zhuǎn)錄本其m5C修飾水平越穩(wěn)定；m5C修飾水平越高的轉(zhuǎn)錄本，其基因表達的穩(wěn)定性（穩(wěn)態(tài)）也越高（圖2B，2C）。這種穩(wěn)定性與mRNA表達水平顯著正相關(guān)（圖2C），提示m5C修飾可能通過增強轉(zhuǎn)錄本穩(wěn)定性來維持表達穩(wěn)態(tài)。這種正相關(guān)性在mRNA的不同區(qū)域（5’UTR， CDS， 3’UTR）均存在（圖2D）。

研究進一步按甲基化水平將基因分為低甲基化組（LMG）和高甲基化組（HMG），LMG組表現(xiàn)出更低的mRNA表達差異（圖2E），且大腦組織擁有最多（48.8%）的組織差異性m5C轉(zhuǎn)錄本（圖2F），這些差異位點主要位于內(nèi)含子（40.9%）和外顯子（28.3%）區(qū)（圖2G）。值得注意的是，組織差異m5C轉(zhuǎn)錄本的修飾水平顯著低于組成型轉(zhuǎn)錄本（圖2H）。

上述結(jié)果共同支持m5C修飾作為基因表達穩(wěn)態(tài)的"穩(wěn)定器"：通過在高表達基因上維持一致的修飾水平，確保發(fā)育關(guān)鍵基因在時空上的精確劑量調(diào)控，而組織特異性低水平修飾介導(dǎo)動態(tài)調(diào)控。

圖2：m5C甲基化與胎兒早期發(fā)育階段的基因表達穩(wěn)態(tài)相關(guān)

（3）胎兒組織與成體組織類型間的m5C修飾動態(tài)變化
為探究m5C修飾的發(fā)育階段動態(tài)變化，研究整合了已發(fā)表的成體組織m5C數(shù)據(jù)（5種匹配組織）進行比較分析（圖3A）。聚類分析顯示胎兒與成體組織階段的m5C修飾基因存在實質(zhì)性差異（圖3B）。全局比較發(fā)現(xiàn)，盡管普遍認為成體甲基化水平更高，但胎兒組織在關(guān)鍵發(fā)育基因上的m5C富集度呈現(xiàn)獨特的分布模式：胎兒大腦組織的m5C水平在FGF、WNT、BMP等神經(jīng)發(fā)育核心通路中顯著偏高（圖3F）。并進一步發(fā)現(xiàn)“獲得性m5C基因”（發(fā)育過程中修飾水平上升）數(shù)量超過丟失性基因（修飾水平下降）（圖3D），且m5C水平變化與mRNA表達呈正相關(guān)（圖3E, G-H）。

不同階段差異分析鑒定出548個腦組織顯著差異m5C基因，這些基因在成體組織階段的m5C和mRNA水平共同上調(diào)（圖3I）。Venn分析篩選出29個（包括Ezh2、Jarid2等表觀調(diào)控因子）在腦發(fā)育和Nsun2敲除模型中共同變化的m5C基因（圖3J），功能富集顯示其高度參與組織分化、前腦發(fā)育、突觸組裝等過程（圖3K）。

圖3：從胎兒期到成體期m5C修飾的動態(tài)變化

（4）m5C介導(dǎo)的可變剪切調(diào)控胎兒發(fā)育過程中的轉(zhuǎn)錄
研究深入分析了胎兒和成體組織中的7類可變剪切（AS）事件（SE、AF/AL、MX、RI、A3/A5）（圖4A），分析結(jié)果揭示，在所有七種組織中，m5C介導(dǎo)的AS事件廣泛存在（圖4B），并且具有高度的組織特異性（七個組織共有m5C-AS基因只有19個）（圖4E）。重要的是，m5C介導(dǎo)的AS組剪切受體包含度（PSI）值低于非m5C介導(dǎo)的AS組（圖4F），但其轉(zhuǎn)錄過程卻更快（圖4G）。

此外，從胎兒期到成體期，m5C介導(dǎo)的AS基因及其PSI值也發(fā)生了動態(tài)變化（圖4H-I）。研究還發(fā)現(xiàn)剪切因子hnRNPL的表達與AS事件數(shù)量正相關(guān)，而其m5C水平與mRNA表達負相關(guān)（圖4L-M），提示了m5C可能通過調(diào)控剪切因子以作用于AS的復(fù)雜機制。

圖4：m5C介導(dǎo)的可變剪切調(diào)控從胎兒期到成體期的RNA轉(zhuǎn)錄

（5）Nsun2缺失導(dǎo)致胎兒大腦發(fā)育異常
基于RNA-BS揭示的腦組織高m5C富集特征，研究構(gòu)建了神經(jīng)前體細胞特異性敲除Nsun2的小鼠模型（Nsun2d/d）（圖5A）。E13.5胎腦分析顯示Nsun2缺失小鼠mRNA和蛋白水平下降90%以上，伴隨小鼠胚胎大腦結(jié)構(gòu)異常。免疫熒光顯示敲除組NeuN+/Tuj1+和Calb1+成熟神經(jīng)元比例顯著升高（圖5B-C），而Sox9+/Nestin+神經(jīng)干細胞、Map2+/Tuj1+未成熟神經(jīng)元比例下降（圖5D-E），提示Nsun2缺失導(dǎo)致神經(jīng)元早熟分化且成熟受損。

具體而言，Nsun2d/d胎兒腦組織的m5C RNA-BS顯示修飾位點數(shù)量、修飾基因數(shù)和全局m5C水平均急劇降低，差異表達基因（DEGs）中下調(diào)基因顯著富集于"組蛋白修飾"和"染色質(zhì)重塑"通路（圖5G-H）。GSEA分析顯示運動發(fā)育、行為調(diào)控和細胞分化相關(guān)基因集顯著抑制（圖5I）。Western blot和IF證實Nsun2d/d導(dǎo)致H3K27me3和H3K9me3修飾水平異常升高（圖5J-O），且該現(xiàn)象在9周齡成體腦中持續(xù)存在。

圖5：Nsun2敲除影響胎兒大腦發(fā)育

（6）Nsun2缺失通過調(diào)控H3K27me3和染色質(zhì)可及性抑制胎兒大腦功能
進一步的CUT&Tag分析發(fā)現(xiàn)，Nsun2敲除導(dǎo)致抑制性組蛋白標記H3K27me3在全基因組轉(zhuǎn)錄起始位點（TSS）區(qū)域的富集密度顯著增強（圖6A），而在如Map2、Foxo1等神經(jīng)元成熟基因的調(diào)控區(qū)域，出現(xiàn)H3K27me3異常沉積并伴隨mRNA表達下降（圖6B-C）。

ATAC-seq分析顯示，Nsun2敲除后全基因組染色質(zhì)可及性增加，TSS區(qū)信號增強（圖6D），共鑒定出7,878個染色質(zhì)開放區(qū)域，包括Tuj1、NeuN等神經(jīng)元標記基因調(diào)控區(qū)（圖6E-F）。這些開放的染色質(zhì)區(qū)域與H3K27me3信號增加相關(guān)，其鄰近基因主要參與軸突發(fā)生、神經(jīng)發(fā)生和前腦發(fā)育等通路（圖6G-H）。這些結(jié)果揭示了Nsun2通過影響m5C修飾，進而調(diào)控組蛋白修飾和染色質(zhì)構(gòu)象，從而調(diào)控神經(jīng)發(fā)育基因程序的核心機制。

圖6：Nsun2缺失影響了胎兒大腦發(fā)育過程中的組蛋白修飾和染色質(zhì)可及性

（7）Nsun2通過Alyref鑒定m5C修飾招募Jarid2/Ezh2并影響其水平
研究人員通過Venn交叉分析Nsun2敲除大腦中的差異m5C基因和胎兒大腦發(fā)育過程中的差異m5C基因，結(jié)果鑒定出兩個關(guān)鍵靶點：組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶Ezh2及其調(diào)控子Jarid2（圖7A）。m5C RNA-BS數(shù)據(jù)顯示，正常發(fā)育過程中和Nsun2敲除后的模型中，Ezh2和Jarid2的m5C水平均顯著降低（圖7-C），但蛋白水平卻異常升高（圖7D-G）。

Co-IP實驗證實，Nsun2能直接與Ezh2和Jarid2互作，而m5C reader蛋白Alyref也能與Ezh2和Jarid2結(jié)合（圖7H-L）。功能挽救實驗表明，在Nsun2敲低的人神經(jīng)前體細胞（hNPCs）中過表達Alyref，或?qū)�Nsun2的催化活性位點突變（C271A， C321A），都能使異常升高的EZH2和JARID2蛋白水平恢復(fù)至正常（圖7M-R），表明m5C修飾水平變化是調(diào)控的關(guān)鍵。mRNA穩(wěn)定性實驗證明Nsun2敲低后EZH2和JARID2 mRNA降解速率減慢（圖7S-T）。揭示m5C通過促進mRNA衰變來調(diào)控蛋白翻譯效率。

上述結(jié)果闡明了一條清晰的調(diào)控軸：Nsun2催化Ezh2/Jarid2 mRNA的m5C修飾，Alyref通過識別該修飾并可能與其他蛋白協(xié)同，調(diào)控這些mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率，從而影響PRC2復(fù)合體活性、H3K27me3水平和最終的神經(jīng)發(fā)育結(jié)局。

圖7：Nsun2/Jarid2/Ezh2/Alyref軸影響了胎兒大腦發(fā)育

（8）Nsun5缺失抑制胎兒大腦發(fā)育
最后，研究探討了另一m5C甲基轉(zhuǎn)移酶Nsun5的功能，Dot Blot顯示Nsun5敲除小鼠胎兒腦組織中整體m5C水平顯著下降（圖8A）。在E18.5期，Nsun5敲除導(dǎo)致成熟神經(jīng)元標記物（NeuN/Satb2， Map2/Tuj1）陽性細胞比例減少（圖8B-E），神經(jīng)前體細胞（Sox2/Nestin）和DNA修復(fù)（Sox2/Rad51）相關(guān)標記物也減少（圖8F-K）。同時，H3K27me3和Ezh2的陽性細胞比例增加（圖8L-O）。這些結(jié)果表明Nsun5同樣對胎兒腦組織發(fā)育至關(guān)重要，其缺失也會導(dǎo)致m5C水平降低和神經(jīng)發(fā)育異常，但其具體作用機制可能與Nsun2/Alyref軸有差異，需要進一步研究。

圖8：Nsun5缺失影響了胎兒大腦發(fā)育

結(jié)論和啟示
本研究通過m5C RNA-BS構(gòu)建了人類胎兒組織m5C調(diào)控圖譜，進一步證實了m5C作為調(diào)控胎兒發(fā)育表觀轉(zhuǎn)錄組標記的重要作用，尤其是在大腦發(fā)育中的Nsun2依賴性修飾網(wǎng)絡(luò)并結(jié)合組蛋白修飾與染色質(zhì)重塑。其中，Nsun2通過催化Jarid2/Ezh2 mRNA的m5C修飾，經(jīng)Alyref識別調(diào)控其mRNA穩(wěn)定性和翻譯效率，進而維持H3K27me3的精確沉積和染色質(zhì)可及性，最終確保神經(jīng)元增殖、分化與成熟的時序性。Nsun5則通過另一通路作用于組蛋白標記，兩者共同構(gòu)成m5C修飾的雙重調(diào)控機制。

m5C RNA-BS技術(shù)是繪制RNA表觀遺傳圖譜、發(fā)現(xiàn)動態(tài)修飾規(guī)律、并最終與表型及深層機制相聯(lián)系的單堿基分辨率檢測技術(shù)。未來類似研究（如不同疾病模型、發(fā)育階段、藥物處理等）均可借鑒此技術(shù)路線，從繪制修飾圖譜入手，結(jié)合多組學(xué)整合分析，系統(tǒng)揭示m5C的調(diào)控功能。

參考文獻：
Hu X, Ding C, Lu J, Li J, Ren X, Xia W, Qian C, Li H, Cheung HH, Huang B. RNA-m5C regulatory atlas of human fetal tissues uncover the activities of Nsun2/Jarid2/Alyref axis. J Adv Res. 2025 Aug 8. doi: 10.1016/j.jare.2025.08.004.