在生命科學研究的微觀世界中，細胞分化是一個動態(tài)、連續(xù)且復雜的過程，涉及大量基因的精密調(diào)控和細胞狀態(tài)的逐步轉(zhuǎn)變。傳統(tǒng) bulk 測序技術(shù)因掩蓋了單細胞層面的異質(zhì)性，無法捕捉細胞分化過程中的中間過渡狀態(tài)，難以完整還原細胞從起始到終末的發(fā)育路徑。而單細胞擬時序分析（Pseudotime Analysis）技術(shù)的問世，打破了這一局限。它以單細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，通過挖掘基因表達的動態(tài)變化規(guī)律，構(gòu)建細胞分化的虛擬時間軸，精準模擬細胞分化軌跡，成為解碼細胞命運決定機制的核心工具，為發(fā)育生物學、腫瘤學、免疫學等領(lǐng)域的研究帶來了突破性進展。

一、技術(shù)核心：理論基礎(chǔ)與核心特征
（一）核心理論支撐
單細胞擬時序分析的核心理論源于對細胞群體異質(zhì)性的深刻認知：細胞發(fā)育并非簡單地劃分為少數(shù)幾個離散階段，而是存在大量連續(xù)且漸進的中間過渡狀態(tài)。這些過渡狀態(tài)是細胞分化過程中基因表達逐步重構(gòu)的關(guān)鍵階段，承載著細胞命運轉(zhuǎn)變的核心信息。通過單細胞測序技術(shù)獲得的單細胞表達譜，能夠真實反映每個細胞的基因表達特征，進而為評估細胞間的親緣關(guān)系、推斷細胞分化順序提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

與傳統(tǒng)的時間序列實驗不同，擬時序分析無需對細胞進行連續(xù)的時間點采樣，而是通過 “橫斷面” 式的單次樣本檢測，利用單細胞表達譜的差異信息，反向推測細胞群體的完整發(fā)育進程，因此被稱為 “擬時序”—— 即通過計算模擬出的細胞發(fā)育時間，而非真實的物理時間。

（二）基因表達的核心規(guī)律
細胞分化過程中，基因表達的動態(tài)變化是擬時序分析的關(guān)鍵依據(jù)，其核心規(guī)律主要體現(xiàn)在兩方面：
特征基因的時相特異性：不同發(fā)育時相的細胞會表達一套特定的特征基因，這些基因通常以轉(zhuǎn)錄因子（TF）為核心，構(gòu)成調(diào)控細胞分化的分子網(wǎng)絡(luò)。例如，在胚胎干細胞向神經(jīng)元分化的過程中，Oct4、Sox2 等多能性轉(zhuǎn)錄因子的表達逐漸下調(diào)，而 NeuroD1、Map2 等神經(jīng)元特異性基因的表達逐步上調(diào)。

表達變化的平穩(wěn)性：在細胞分化的連續(xù)過程中，特征基因的表達并非劇烈波動，而是呈現(xiàn)出平穩(wěn)上升或平穩(wěn)下降的趨勢。擬時序分析的核心目標就是捕捉這種平穩(wěn)變化的基因表達模式，通過對細胞進行合理排序，讓大部分基因的表達在虛擬時間軸上實現(xiàn)平滑過渡，從而真實還原細胞分化的分子動態(tài)過程。

二、關(guān)鍵原理：算法邏輯與軌跡構(gòu)建
單細胞擬時序分析的核心是通過算法構(gòu)建能夠反映細胞分化關(guān)系的軌跡圖，其底層邏輯與關(guān)鍵步驟如下：

（一）核心算法：最小生成樹（Minimum Spanning Tree, MST）     
擬時序分析中最常用的軌跡構(gòu)建算法基于最小生成樹原理。最小生成樹是指在一個包含多個節(jié)點的無向圖中，找到一棵連接所有節(jié)點且邊的權(quán)重之和最小的樹。在單細胞數(shù)據(jù)中，每個細胞被視為一個節(jié)點，節(jié)點間的權(quán)重由細胞表達譜的相似性（如歐氏距離、皮爾遜相關(guān)系數(shù)等）決定 —— 表達譜越相似的細胞，節(jié)點間的權(quán)重越小。通過構(gòu)建最小生成樹，能夠找到連接所有細胞的最短路徑之和，從而建立起細胞之間的 “親緣關(guān)系” 網(wǎng)絡(luò)，為后續(xù)的細胞排序提供基礎(chǔ)。

（二）細胞排序與軌跡優(yōu)化
在最小生成樹的基礎(chǔ)上，結(jié)合基因表達的平穩(wěn)性規(guī)律，對所有細胞進行時間排序： 
首先識別出具有顯著時相特異性的特征基因（即表達隨分化過程平穩(wěn)變化的基因）；
以這些特征基因為依據(jù)，對最小生成樹中的細胞節(jié)點進行順序調(diào)整，使特征基因的表達在節(jié)點序列上呈現(xiàn)連續(xù)的上升或下降趨勢；
最終形成的細胞序列即為擬時序軸，軸上的每個位置代表細胞在分化過程中的一個特定狀態(tài)，而整個序列構(gòu)成的分支結(jié)構(gòu)則對應細胞分化的不同路徑（如單向分化、分支分化等）。 

此外，軌跡構(gòu)建后還可根據(jù)研究需求進行優(yōu)化，例如重新選擇時序方向（reverse）—— 當初始排序的分化方向與已知生物學事實不符時，可反轉(zhuǎn)擬時序軸；或指定起始狀態(tài)（root_state）—— 通過已知的干細胞或前體細胞標記基因，確定擬時序軸的起點，提升軌跡的生物學合理性。     

（三）不同軌跡類型的適配
根據(jù)細胞分化的實際情況，擬時序分析可構(gòu)建多種類型的軌跡，以適配不同的生物學場景：  
線性軌跡：適用于細胞向單一方向分化的場景（如造血干細胞向紅細胞分化）；
分支軌跡：適用于細胞分化過程中出現(xiàn)命運分支的場景（如神經(jīng)嵴細胞分化為神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞或平滑肌細胞）；
循環(huán)軌跡：適用于細胞存在周期性狀態(tài)變化的場景（如細胞周期、干細胞自我更新與分化的循環(huán)）。          

三、標準化分析步驟
（一）特征選擇
特征基因的篩選是擬時序分析的基礎(chǔ)，直接影響后續(xù)軌跡構(gòu)建的準確性，主要通過三種方式實現(xiàn)：
高表達基因篩選：選取所有平均表達量（mean_expr）＞0.1 的高表達基因，這類基因能夠為細胞狀態(tài)區(qū)分提供穩(wěn)定的表達信號；

亞群特異基因篩選：可導入 Seurat 軟件計算得到的特征基因，或利用 Monocle 軟件分析獲得的差異表達基因（DEG），這類基因具有細胞亞群特異性，能精準反映不同細胞群體的分化特征；

手動輸入基因：基于已有的先驗知識，手動輸入與目標發(fā)育過程相關(guān)的已知基因集，進一步提升分析的針對性與有效性。

（二）數(shù)據(jù)降維與批次效應去除
在特征選擇之后，需要進行數(shù)據(jù)降維處理。數(shù)據(jù)降維能夠剔除冗余信息，讓細胞軌跡更加簡潔清晰，同時減少后續(xù)計算的復雜度。此外，若數(shù)據(jù)存在批次效應，需通過相應的技術(shù)手段去除，以避免批次差異對軌跡構(gòu)建的干擾，確保分析結(jié)果的可靠性。

（三）細胞時間排序
這是擬時序分析的核心環(huán)節(jié)，需要對所有細胞進行順序調(diào)換，以匹配模擬的分化軌跡。該過程往往需要消耗大量的計算資源和時間，且在分析過程中可根據(jù)實際研究需求，重新選擇時序方向（reverse）和起始狀態(tài)（root_state），從而更靈活地探索細胞分化的潛在路徑。

四、技術(shù)應用核心場景
單細胞擬時序分析憑借其強大的軌跡構(gòu)建與動態(tài)解析能力，已廣泛應用于多個生命科學研究領(lǐng)域：  
發(fā)育生物學：解析胚胎與器官發(fā)育中細胞分化路徑及調(diào)控機制，如還原小鼠胚胎干細胞向三胚層分化軌跡，識別關(guān)鍵調(diào)控因子；

腫瘤學：揭示腫瘤細胞異質(zhì)性與分化層級，探索腫瘤干細胞起源擴散，如發(fā)現(xiàn)肺癌細胞多表型分化分支，為靶向治療提供依據(jù)；

免疫學：追蹤免疫細胞發(fā)育成熟與活化軌跡，如T細胞胸腺到外周的分化、B細胞免疫應答中的增殖分化路徑；

再生醫(yī)學：評估干細胞移植后分化命運，優(yōu)化治療方案，如分析間充質(zhì)干細胞向功能細胞分化軌跡，驗證移植效果。

五、LabEx單細胞測序服務(wù)


單細胞擬時序分析作為單細胞測序技術(shù)體系中的核心分析模塊，廣泛應用于發(fā)育生物學、腫瘤學、免疫學等多個研究領(lǐng)域，為解析細胞分化機制、腫瘤異質(zhì)性、免疫細胞發(fā)育成熟等關(guān)鍵科學問題提供了重要的技術(shù)支撐。 為助力相關(guān)研究的開展，LabEx提供全面的單細胞測序配套服務(wù)，涵蓋三大核心服務(wù)類型：

1. 單細胞轉(zhuǎn)錄組測序（ScRNA-seq）：在單細胞水平對全mRNA表達譜進行精準檢測，為擬時序分析提供核心數(shù)據(jù)基礎(chǔ)；

2. 單細胞蛋白檢測（Ab-seq）：實現(xiàn)單細胞水平蛋白與基因表達的聯(lián)合檢測，屬于多組學研究范疇，可提供人蛋白249個+小鼠蛋白219個的抗體組合，更大panel支持定制化服務(wù)；

3. 單細胞免疫組庫測序：通過富集TCR/BCR基因并測序，全面解析免疫組庫多樣性，支持多種屬檢測，為免疫細胞相關(guān)的擬時序分析提供專屬解決方案。

同時，LabEx搭建了完整的單細胞研究工作流程，從樣本制備、單細胞分離、基因捕獲、文庫構(gòu)建、測序到數(shù)據(jù)分析，配備專業(yè)的實驗設(shè)備（如美天旎MACS八通道全自動組織處理器、SEOGEO上樣工作站等）和數(shù)據(jù)分析軟件，提供一站式的技術(shù)支持，確保從實驗數(shù)據(jù)到擬時序分析結(jié)果的高效轉(zhuǎn)化，為科研工作者提供可靠的技術(shù)保障。

樂備實是國內(nèi)專注于提供高質(zhì)量蛋白檢測以及組學分析服務(wù)的實驗服務(wù)專家，自2018年成立以來，樂備實不斷尋求突破，公司的服務(wù)技術(shù)平臺已擴展到單細胞測序、空間多組學、流式檢測、超敏電化學發(fā)光、Luminex多因子檢測、抗體芯片、PCR Array、ELISA、Elispot、PLA蛋白互作、多色免疫組化、DSP空間多組學等30多個，建立起了一套涵蓋基因、蛋白、細胞以及組織水平實驗的完整檢測體系。