WGS等技術(shù)助力揭示多發(fā)性骨髓瘤免疫逃逸介導(dǎo)CAR-T耐藥的遺傳
2025年7月10日，徐州醫(yī)科大學(xué)牛銘山教授和姚瑤教授團隊合作，在國際血液學(xué)頂級期刊《Blood》（IF 23.1/Q1）上發(fā)表題為“Genetic and epigenetic mechanisms of GPRC5D loss after anti-GPRC5D CAR T-cell therapy in multiple myeloma”的重磅研究成果。此研究聚焦于多發(fā)性骨髓瘤（MM）患者接受靶向GPRC5D CAR-T細(xì)胞治療后復(fù)發(fā)的耐藥機制，利用整合全基因組測序（WGS）和全基因組甲基化測序（WGBS）技術(shù)，系統(tǒng)解析了GPRC5D抗原逃逸介導(dǎo)疾病復(fù)發(fā)的遺傳學(xué)（雙等位基因缺失，如純合缺失）與表觀遺傳學(xué)（DNA高甲基化）雙重機制，并通過靶基因DNA甲基化測序（Target-BS）技術(shù)在臨床前模型中首次驗證了去甲基化藥物（阿扎胞苷）可逆轉(zhuǎn)GPRC5D表觀遺傳沉默，為克服CAR-T耐藥提供了精準(zhǔn)干預(yù)新策略。
標(biāo)題：Genetic and epigenetic mechanisms of GPRC5D loss after anti-GPRC5D CAR T-cell therapy in multiple myeloma（多發(fā)性骨髓瘤抗GPRC5D CAR-T細(xì)胞治療后GPRC5D逃逸的遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)機制）
發(fā)表時間：2025-7-10
發(fā)表期刊：Blood
影響因子：IF23.1/Q1
技術(shù)平臺：WGS、WGBS、Target-BS
作者單位：徐州醫(yī)科大學(xué)、天津科技大學(xué)、美國哈佛醫(yī)學(xué)院
DOI：10.1182/blood.2024026622
研究納入10例抗GPRC5D CAR-T治療后復(fù)發(fā)MM患者，對其復(fù)發(fā)期骨髓瘤細(xì)胞樣本進行WGS和WGBS聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)80%病人出現(xiàn)GPRC5D抗原逃逸（丟失）或表達(dá)顯著降低。其中3例存在顯著GPRC5D雙等位基因失活（純合缺失或調(diào)控區(qū)域雙等位缺失），而其余7例無基因突變的患者中，5例檢出GPRC5D轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域多位點高甲基化。此外，體外實驗證實，多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系的GPRC5D表達(dá)水平與其調(diào)控區(qū)域的甲基化水平呈顯著負(fù)相關(guān)，而阿扎胞苷干預(yù)可顯著恢復(fù)高甲基化細(xì)胞系（KMS11、IM9、RPMI-8226）的GPRC5D mRNA和蛋白表達(dá)。本研究不僅揭示了GPRC5D 逃逸和CAR-T治療耐藥的核心機制，更闡明了DNA甲基化動態(tài)監(jiān)測在預(yù)測復(fù)發(fā)和干預(yù)中的關(guān)鍵價值。
研究方法
患者樣本：納入10例接受抗GPRC5D CAR-T治療后復(fù)發(fā)的MM患者，收集其復(fù)發(fā)期骨髓瘤細(xì)胞（CD138+）及配對正常細(xì)胞。
全基因組測序：對復(fù)發(fā)期CD138+ MM細(xì)胞及配對正常細(xì)胞進行WGS，檢測拷貝數(shù)變異（CNV）、結(jié)構(gòu)變異（SV）及單核苷酸變異（SNV），重點篩查GPRC5D位點的基因突變。
全基因組甲基化測序：分析全基因組甲基化水平差異，比較復(fù)發(fā)組MM細(xì)胞、未接受GPRC5D治療的對照MM細(xì)胞及正常漿細(xì)胞的甲基化圖譜，鑒定差異甲基化區(qū)域（DMRs）和差異甲基化位點（DMLs），篩選候選基因GPRC5D轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件（啟動子、增強子及基因間區(qū)）的CpG甲基化水平。
靶基因甲基化測序：靶向GPRC5D調(diào)控區(qū)域設(shè)計靶向捕獲探針，在7種MM細(xì)胞系（KMS11、IM9、JJN3、RPMI-8226、KMS12-PE、NCI-H929、MM1S）中進行Target-BS高深度甲基化檢測，驗證特定CpG位點的甲基化狀態(tài)和關(guān)鍵差異位點，并建立甲基化水平與基因表達(dá)的定量關(guān)聯(lián)模型。
實驗驗證：
（1）接受抗GPRC5D CAR-T治療后復(fù)發(fā)患者的臨床特征
本研究納入的10例MM復(fù)發(fā)患者中，中位年齡57.5歲（44-66歲），性別分布均衡。值得注意的是，90%患者存在高危細(xì)胞基因突變，80%為R-ISS II/III期，且既往接受過多線治療（中位3.5線），提示該隊列代表了臨床上難治程度較高的MM人群。4例患者曾接受自體造血干細(xì)胞移植，1例患者（P10）在接受抗GPRC5D CAR-T前已接受抗BCMA CAR-T序貫治療并進展為漿細(xì)胞白血病伴髓外病變（EMD）。CAR-T治療后，所有患者均達(dá)到完全緩解（CR）或更好療效，中位達(dá)最佳緩解時間為2.5個月，但中位無進展生存期（PFS）僅15.9個月（3-26.5個月），凸顯復(fù)發(fā)問題的嚴(yán)峻性。免疫學(xué)監(jiān)測顯示，8例患者復(fù)發(fā)時GPRC5D表達(dá)完全陰性，2例呈GPRC5D+/-混合表達(dá)但以陰性細(xì)胞為主，提示抗原陰性逃逸是抗GPRC5D CAR-T治療后復(fù)發(fā)的主導(dǎo)模式。這一特征顯著區(qū)別于抗BCMA CAR-T治療后常見的抗原陽性復(fù)發(fā)模式，為后續(xù)機制探索指明了方向。
（2）抗GPRC5D CAR-T治療后GPRC5D基因的雙等位缺失
患者1為女性MM復(fù)發(fā)患者，在接受抗GPRC5D CAR-T治療后18個月復(fù)發(fā)，骨髓漿細(xì)胞浸潤達(dá)24%。WGS分析揭示其染色體12p區(qū)域存在264 kb雜合缺失和22 kb純合缺失，完全覆蓋GPRC5D基因編碼區(qū)，導(dǎo)致雙等位基因失活。qPCR驗證實驗顯示復(fù)發(fā)樣本中同時檢出雜合和純合缺失拷貝（基線樣本均陰性），證實該缺失為治療后獲得性克隆選擇或治療前極低頻克隆擴增所致。IHC染色顯示，GPRC5D在基線高表達(dá)，復(fù)發(fā)后完全缺失，而CD138表達(dá)保持穩(wěn)定，驗證其抗原逃逸的特異性。此案例首次在GPRC5D CAR-T背景下證實純合缺失是抗原逃逸的主要機制，與BCMA CAR-T耐藥機制高度相似，提示不同靶點CAR-T治療面臨共同的基因突變逃逸風(fēng)險。
（3）CAR-T治療后GPRC5D調(diào)控區(qū)域的純合缺失
患者6為復(fù)雜性核型κ輕鏈MM，GPRC5D CAR-T治療后13.9個月復(fù)發(fā)并進展為漿細(xì)胞白血病。WGS測序分析揭示其12號染色體上三個缺失片段：13.1 Mb雜合缺失、12.7 Mb雜合缺失和68.2 kb純合缺失。qPCR證實缺失斷點僅見于復(fù)發(fā)樣本，且純合缺失覆蓋GPRC5D啟動子及增強子區(qū)域，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄徹底沉默。RNA-seq未檢出缺失exon1的替代轉(zhuǎn)錄本，證實該缺失的功能破壞性。IHC顯示復(fù)發(fā)樣本中GPRC5D陰性細(xì)胞占主導(dǎo)，但仍有36.7%細(xì)胞保留GPRC5D表達(dá)，與qPCR評估的亞克隆比例高度吻合。表明調(diào)控區(qū)域缺失可通過破壞轉(zhuǎn)錄啟動導(dǎo)致抗原免疫逃逸，僅需小片段雙等位缺失即可實現(xiàn)抗原沉默，且可與其他亞克隆的雜合缺失共存，形成復(fù)雜的克隆異質(zhì)性圖譜。該機制在CAR-T領(lǐng)域?qū)偈状蜗到y(tǒng)證實。
（4）CAR免疫風(fēng)險導(dǎo)致BCMA與GPRC5D雙重丟失
患者10序貫接受抗BCMA CAR-T（4個月后復(fù)發(fā)）和抗GPRC5D CAR-T治療（3個月后再次復(fù)發(fā)），該IgG-κ型MM女性經(jīng)7線治療后進展為漿細(xì)胞白血病伴腹部EMD。復(fù)發(fā)樣本的WGS分析揭示16號染色體存在1.02 Mb雜合缺失和5個局灶性純合缺失，導(dǎo)致TNFRSF17（BCMA編碼基因）雙等位失活；12號染色體則存在13.3 Mb雜合缺失和3個局灶性純合缺失，導(dǎo)致GPRC5D雙等位失活。qPCR驗證至少5個TNFRSF17和3個GPRC5D純合缺失斷點，提示基因組不穩(wěn)定性驅(qū)動下多克隆并行演化。該患者經(jīng)多線治療后演變?yōu)橹辽?5條染色體的復(fù)雜核型，證實患者基因組不穩(wěn)定性容易介導(dǎo)多靶點抗原丟失。流式與IHC實驗結(jié)果顯示，治療前BCMA與GPRC5D雙高表達(dá)，復(fù)發(fā)后雙抗原均陰性，導(dǎo)致CAR-T策略失效。此案例分析結(jié)果表明，對于基因組不穩(wěn)定的高�；颊撸瑔伟悬c序貫治療可能加速多抗原逃逸，多靶點CAR-T（如BCMA/GPRC5D雙特異CAR）或聯(lián)合去甲基化干預(yù)可能是更優(yōu)選擇。
（5）CAR-T治療后復(fù)發(fā)MM細(xì)胞中GPRC5D的表觀遺傳沉默
在7例WGS未檢出GPRC5D基因突變的復(fù)發(fā)患者中，WGBS分析結(jié)果顯示5例MM復(fù)發(fā)患者存在GPRC5D調(diào)控區(qū)域高甲基化，靶向甲基化測序（Target-BS）分析結(jié)果顯示多個CpG位點甲基化水平與GPRC5D表達(dá)負(fù)相關(guān)，揭示表觀遺傳重編程是主要逃逸機制。具體而言，復(fù)發(fā)MM細(xì)胞的全基因組甲基化水平相較于正常漿細(xì)胞呈顯著低甲基化（MM特征），但相較于未接受GPRC5D治療的對照MM細(xì)胞則表現(xiàn)為高甲基化，WGBS共鑒定出735.8萬高甲基化DMLs和72萬高甲基化DMRs，提示CAR-T治療誘導(dǎo)特異性甲基化重編程。靶向GPRC5D位點的Target-BS測序分析揭示，5例復(fù)發(fā)患者在轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件（啟動子、增強子及內(nèi)含子-外顯子邊界）呈現(xiàn)多位點高甲基化，而7例對照MM樣本該區(qū)域均維持低甲基化狀態(tài)。值得注意的是，兩例正常漿細(xì)胞對照（GPRC5D陽性率僅10.1%和12.9%）也在該區(qū)域顯示高甲基化，提示GPRC5D甲基化水平與表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。
細(xì)胞系實驗中，阿扎胞苷處理可誘導(dǎo)高甲基化細(xì)胞系（如RPMI-8226）的GPRC5D mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)，證明DNA高甲基化是獨立的抗原沉默機制。
(C) IGV展示GPRC5D位點的DNA甲基化圖譜。
(B) 多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系中GPRC5D mRNA表達(dá)的qPCR分析。
(C) GPRC5D mRNA水平倍數(shù)變化與其調(diào)控區(qū)差異甲基化CpG位點平均甲基化水平之間的相關(guān)性分析。
(D) 阿扎胞苷處理誘導(dǎo)GPRC5D mRNA表達(dá)增加。
(E) 流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示，RPMI-8226細(xì)胞經(jīng)72小時阿扎胞苷處理后GPRC5D蛋白表達(dá)升高。
結(jié)論和啟示
本研究證實GPRC5D免疫逃逸是CAR-T耐藥的主要機制，且存在表觀遺傳沉默與遺傳缺失。研究者發(fā)現(xiàn)去甲基化藥物在細(xì)胞系中可部分逆轉(zhuǎn)沉默，但臨床轉(zhuǎn)化需進一步優(yōu)化給藥策略。總之，靶向GPRC5D的聯(lián)合療法（如CAR-T+去甲基化藥物）可能是克服耐藥的新方向，未來研究需動態(tài)監(jiān)測甲基化水平，實現(xiàn)耐藥克隆的早期干預(yù)。
易基因的TBS技術(shù)是本研究從發(fā)現(xiàn)到驗證的關(guān)鍵工具。TBS通過靶向捕獲實現(xiàn)了：
超高深度：在GPRC5D調(diào)控區(qū)達(dá)到500×以上測序深度，精確檢測單個CpG位點甲基化水平，分辨低豐度耐藥亞克�。�<5%）。
成本效益：適合大規(guī)模樣本隊列（如本研究7個細(xì)胞系+多例臨床樣本）的快速驗證，為WGBS發(fā)現(xiàn)的重要DMRs提供經(jīng)濟可行的臨床轉(zhuǎn)化路徑。
功能關(guān)聯(lián)：TBS數(shù)據(jù)與qPCR表達(dá)數(shù)據(jù)精準(zhǔn)配對，建立甲基化-表達(dá)回歸模型，篩選出調(diào)控效能最強的CpG位點，為后續(xù)開發(fā)甲基化特異性引物用于MRD監(jiān)測提供靶點。
參考文獻(xiàn)：
Ma S, Xia J, Zhang M, Li W, Xiao M, Sha Y, Wang W, Zhou J, Wang Y, Qi K, Fu C, Sun Z, Zhou D, Sun Q, Qiu T, Yan Z, Zhu F, Chen W, Cheng H, Sang W, Cao J, Li D, Li ZZ, Fulciniti M, Yao Y, Xu K, Niu M. Genetic and epigenetic mechanisms of GPRC5D loss after anti-GPRC5D CAR T-cell therapy in multiple myeloma. Blood. 2025 Mar 16. doi: 10.1182/blood.2024026622.
標(biāo)題：Genetic and epigenetic mechanisms of GPRC5D loss after anti-GPRC5D CAR T-cell therapy in multiple myeloma（多發(fā)性骨髓瘤抗GPRC5D CAR-T細(xì)胞治療后GPRC5D逃逸的遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)機制）
發(fā)表時間：2025-7-10
發(fā)表期刊：Blood
影響因子：IF23.1/Q1
技術(shù)平臺：WGS、WGBS、Target-BS
作者單位：徐州醫(yī)科大學(xué)、天津科技大學(xué)、美國哈佛醫(yī)學(xué)院
DOI：10.1182/blood.2024026622
研究納入10例抗GPRC5D CAR-T治療后復(fù)發(fā)MM患者，對其復(fù)發(fā)期骨髓瘤細(xì)胞樣本進行WGS和WGBS聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)80%病人出現(xiàn)GPRC5D抗原逃逸（丟失）或表達(dá)顯著降低。其中3例存在顯著GPRC5D雙等位基因失活（純合缺失或調(diào)控區(qū)域雙等位缺失），而其余7例無基因突變的患者中，5例檢出GPRC5D轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域多位點高甲基化。此外，體外實驗證實，多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系的GPRC5D表達(dá)水平與其調(diào)控區(qū)域的甲基化水平呈顯著負(fù)相關(guān)，而阿扎胞苷干預(yù)可顯著恢復(fù)高甲基化細(xì)胞系（KMS11、IM9、RPMI-8226）的GPRC5D mRNA和蛋白表達(dá)。本研究不僅揭示了GPRC5D 逃逸和CAR-T治療耐藥的核心機制，更闡明了DNA甲基化動態(tài)監(jiān)測在預(yù)測復(fù)發(fā)和干預(yù)中的關(guān)鍵價值。
- 抗原陰性逃逸是多發(fā)性骨髓瘤患者接受抗GPRC5D CAR-T細(xì)胞治療后復(fù)發(fā)的關(guān)鍵驅(qū)動因子。
- GPRC5D純合缺失和高甲基化是靶向抗原逃逸的重要機制。
研究摘要
研究方法
患者樣本：納入10例接受抗GPRC5D CAR-T治療后復(fù)發(fā)的MM患者，收集其復(fù)發(fā)期骨髓瘤細(xì)胞（CD138+）及配對正常細(xì)胞。
全基因組測序：對復(fù)發(fā)期CD138+ MM細(xì)胞及配對正常細(xì)胞進行WGS，檢測拷貝數(shù)變異（CNV）、結(jié)構(gòu)變異（SV）及單核苷酸變異（SNV），重點篩查GPRC5D位點的基因突變。
全基因組甲基化測序：分析全基因組甲基化水平差異，比較復(fù)發(fā)組MM細(xì)胞、未接受GPRC5D治療的對照MM細(xì)胞及正常漿細(xì)胞的甲基化圖譜，鑒定差異甲基化區(qū)域（DMRs）和差異甲基化位點（DMLs），篩選候選基因GPRC5D轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件（啟動子、增強子及基因間區(qū)）的CpG甲基化水平。
靶基因甲基化測序：靶向GPRC5D調(diào)控區(qū)域設(shè)計靶向捕獲探針，在7種MM細(xì)胞系（KMS11、IM9、JJN3、RPMI-8226、KMS12-PE、NCI-H929、MM1S）中進行Target-BS高深度甲基化檢測，驗證特定CpG位點的甲基化狀態(tài)和關(guān)鍵差異位點，并建立甲基化水平與基因表達(dá)的定量關(guān)聯(lián)模型。
實驗驗證：
- qPCR：驗證WGS檢出的GPRC5D和TNFRSF17缺失斷點；檢測GPRC5D mRNA表達(dá)。
- 流式細(xì)胞術(shù)：GPRC5D抗體和BCMA抗體檢測抗原陽性率，評估CAR-T治療后抗原表達(dá)動態(tài)變化。
- 免疫組織化學(xué)（IHC）：抗GPRC5D抗體和抗CD138抗體進行染色評估蛋白表達(dá)缺失。
- 藥物干預(yù)實驗：用1或3μM阿扎胞苷處理高甲基化MM細(xì)胞系，評估GPRC5D表達(dá)恢復(fù)情況。
（1）接受抗GPRC5D CAR-T治療后復(fù)發(fā)患者的臨床特征
本研究納入的10例MM復(fù)發(fā)患者中，中位年齡57.5歲（44-66歲），性別分布均衡。值得注意的是，90%患者存在高危細(xì)胞基因突變，80%為R-ISS II/III期，且既往接受過多線治療（中位3.5線），提示該隊列代表了臨床上難治程度較高的MM人群。4例患者曾接受自體造血干細(xì)胞移植，1例患者（P10）在接受抗GPRC5D CAR-T前已接受抗BCMA CAR-T序貫治療并進展為漿細(xì)胞白血病伴髓外病變（EMD）。CAR-T治療后，所有患者均達(dá)到完全緩解（CR）或更好療效，中位達(dá)最佳緩解時間為2.5個月，但中位無進展生存期（PFS）僅15.9個月（3-26.5個月），凸顯復(fù)發(fā)問題的嚴(yán)峻性。免疫學(xué)監(jiān)測顯示，8例患者復(fù)發(fā)時GPRC5D表達(dá)完全陰性，2例呈GPRC5D+/-混合表達(dá)但以陰性細(xì)胞為主，提示抗原陰性逃逸是抗GPRC5D CAR-T治療后復(fù)發(fā)的主導(dǎo)模式。這一特征顯著區(qū)別于抗BCMA CAR-T治療后常見的抗原陽性復(fù)發(fā)模式，為后續(xù)機制探索指明了方向。
圖1：分別靶向GPRC5D或BCMA CAR-T細(xì)胞治療的臨床療效
（2）抗GPRC5D CAR-T治療后GPRC5D基因的雙等位缺失
患者1為女性MM復(fù)發(fā)患者，在接受抗GPRC5D CAR-T治療后18個月復(fù)發(fā)，骨髓漿細(xì)胞浸潤達(dá)24%。WGS分析揭示其染色體12p區(qū)域存在264 kb雜合缺失和22 kb純合缺失，完全覆蓋GPRC5D基因編碼區(qū)，導(dǎo)致雙等位基因失活。qPCR驗證實驗顯示復(fù)發(fā)樣本中同時檢出雜合和純合缺失拷貝（基線樣本均陰性），證實該缺失為治療后獲得性克隆選擇或治療前極低頻克隆擴增所致。IHC染色顯示，GPRC5D在基線高表達(dá)，復(fù)發(fā)后完全缺失，而CD138表達(dá)保持穩(wěn)定，驗證其抗原逃逸的特異性。此案例首次在GPRC5D CAR-T背景下證實純合缺失是抗原逃逸的主要機制，與BCMA CAR-T耐藥機制高度相似，提示不同靶點CAR-T治療面臨共同的基因突變逃逸風(fēng)險。
圖2：抗GPRC5D CAR-T細(xì)胞治療后患者1的GPRC5D基因雙等位缺失
（3）CAR-T治療后GPRC5D調(diào)控區(qū)域的純合缺失
患者6為復(fù)雜性核型κ輕鏈MM，GPRC5D CAR-T治療后13.9個月復(fù)發(fā)并進展為漿細(xì)胞白血病。WGS測序分析揭示其12號染色體上三個缺失片段：13.1 Mb雜合缺失、12.7 Mb雜合缺失和68.2 kb純合缺失。qPCR證實缺失斷點僅見于復(fù)發(fā)樣本，且純合缺失覆蓋GPRC5D啟動子及增強子區(qū)域，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄徹底沉默。RNA-seq未檢出缺失exon1的替代轉(zhuǎn)錄本，證實該缺失的功能破壞性。IHC顯示復(fù)發(fā)樣本中GPRC5D陰性細(xì)胞占主導(dǎo)，但仍有36.7%細(xì)胞保留GPRC5D表達(dá)，與qPCR評估的亞克隆比例高度吻合。表明調(diào)控區(qū)域缺失可通過破壞轉(zhuǎn)錄啟動導(dǎo)致抗原免疫逃逸，僅需小片段雙等位缺失即可實現(xiàn)抗原沉默，且可與其他亞克隆的雜合缺失共存，形成復(fù)雜的克隆異質(zhì)性圖譜。該機制在CAR-T領(lǐng)域?qū)偈状蜗到y(tǒng)證實。
圖3：CAR-T細(xì)胞治療后患者6的GPRC5D調(diào)控元件純合缺失
（4）CAR免疫風(fēng)險導(dǎo)致BCMA與GPRC5D雙重丟失
患者10序貫接受抗BCMA CAR-T（4個月后復(fù)發(fā)）和抗GPRC5D CAR-T治療（3個月后再次復(fù)發(fā)），該IgG-κ型MM女性經(jīng)7線治療后進展為漿細(xì)胞白血病伴腹部EMD。復(fù)發(fā)樣本的WGS分析揭示16號染色體存在1.02 Mb雜合缺失和5個局灶性純合缺失，導(dǎo)致TNFRSF17（BCMA編碼基因）雙等位失活；12號染色體則存在13.3 Mb雜合缺失和3個局灶性純合缺失，導(dǎo)致GPRC5D雙等位失活。qPCR驗證至少5個TNFRSF17和3個GPRC5D純合缺失斷點，提示基因組不穩(wěn)定性驅(qū)動下多克隆并行演化。該患者經(jīng)多線治療后演變?yōu)橹辽?5條染色體的復(fù)雜核型，證實患者基因組不穩(wěn)定性容易介導(dǎo)多靶點抗原丟失。流式與IHC實驗結(jié)果顯示，治療前BCMA與GPRC5D雙高表達(dá)，復(fù)發(fā)后雙抗原均陰性，導(dǎo)致CAR-T策略失效。此案例分析結(jié)果表明，對于基因組不穩(wěn)定的高�；颊撸瑔伟悬c序貫治療可能加速多抗原逃逸，多靶點CAR-T（如BCMA/GPRC5D雙特異CAR）或聯(lián)合去甲基化干預(yù)可能是更優(yōu)選擇。
圖4：患者10接受序貫抗BCMA和抗GPRC5D CAR-T細(xì)胞治療后BCMA與GPRC5D雙重丟失
圖5：全基因組測序（WGS）揭示BCMA和GPRC5D雙重丟失的基因組學(xué)機制
（5）CAR-T治療后復(fù)發(fā)MM細(xì)胞中GPRC5D的表觀遺傳沉默
在7例WGS未檢出GPRC5D基因突變的復(fù)發(fā)患者中，WGBS分析結(jié)果顯示5例MM復(fù)發(fā)患者存在GPRC5D調(diào)控區(qū)域高甲基化，靶向甲基化測序（Target-BS）分析結(jié)果顯示多個CpG位點甲基化水平與GPRC5D表達(dá)負(fù)相關(guān)，揭示表觀遺傳重編程是主要逃逸機制。具體而言，復(fù)發(fā)MM細(xì)胞的全基因組甲基化水平相較于正常漿細(xì)胞呈顯著低甲基化（MM特征），但相較于未接受GPRC5D治療的對照MM細(xì)胞則表現(xiàn)為高甲基化，WGBS共鑒定出735.8萬高甲基化DMLs和72萬高甲基化DMRs，提示CAR-T治療誘導(dǎo)特異性甲基化重編程。靶向GPRC5D位點的Target-BS測序分析揭示，5例復(fù)發(fā)患者在轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件（啟動子、增強子及內(nèi)含子-外顯子邊界）呈現(xiàn)多位點高甲基化，而7例對照MM樣本該區(qū)域均維持低甲基化狀態(tài)。值得注意的是，兩例正常漿細(xì)胞對照（GPRC5D陽性率僅10.1%和12.9%）也在該區(qū)域顯示高甲基化，提示GPRC5D甲基化水平與表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。
細(xì)胞系實驗中，阿扎胞苷處理可誘導(dǎo)高甲基化細(xì)胞系（如RPMI-8226）的GPRC5D mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)，證明DNA高甲基化是獨立的抗原沉默機制。
圖6：GPRC5D CAR-T細(xì)胞治療后多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中GPRC5D位點的DNA高甲基化。
(A-B) 復(fù)發(fā)MM組與正常漿細(xì)胞(A)及對照MM組(B)相比，低甲基化或高甲基化差異甲基化區(qū)域(DMRs)的圈圖。圖中突出顯示前10,000個DMRs。圈位置表示甲基化差異的顯著性，紅色圓圈代表高甲基化DMRs，其位置越靠外表示顯著性越高；藍(lán)色圓圈代表低甲基化DMRs，其位置越靠內(nèi)表示顯著性越高。(C) IGV展示GPRC5D位點的DNA甲基化圖譜。
圖7：多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系中GPRC5D表達(dá)與甲基化水平的相關(guān)性。
(A) 7種多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系GPRC5D基因調(diào)控區(qū)域靶基因甲基化Target-BS分析。IGV可視化展示CpG位點的甲基化信號。(B) 多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系中GPRC5D mRNA表達(dá)的qPCR分析。
(C) GPRC5D mRNA水平倍數(shù)變化與其調(diào)控區(qū)差異甲基化CpG位點平均甲基化水平之間的相關(guān)性分析。
(D) 阿扎胞苷處理誘導(dǎo)GPRC5D mRNA表達(dá)增加。
(E) 流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示，RPMI-8226細(xì)胞經(jīng)72小時阿扎胞苷處理后GPRC5D蛋白表達(dá)升高。
結(jié)論和啟示
本研究證實GPRC5D免疫逃逸是CAR-T耐藥的主要機制，且存在表觀遺傳沉默與遺傳缺失。研究者發(fā)現(xiàn)去甲基化藥物在細(xì)胞系中可部分逆轉(zhuǎn)沉默，但臨床轉(zhuǎn)化需進一步優(yōu)化給藥策略。總之，靶向GPRC5D的聯(lián)合療法（如CAR-T+去甲基化藥物）可能是克服耐藥的新方向，未來研究需動態(tài)監(jiān)測甲基化水平，實現(xiàn)耐藥克隆的早期干預(yù)。
易基因的TBS技術(shù)是本研究從發(fā)現(xiàn)到驗證的關(guān)鍵工具。TBS通過靶向捕獲實現(xiàn)了：
超高深度：在GPRC5D調(diào)控區(qū)達(dá)到500×以上測序深度，精確檢測單個CpG位點甲基化水平，分辨低豐度耐藥亞克�。�<5%）。
成本效益：適合大規(guī)模樣本隊列（如本研究7個細(xì)胞系+多例臨床樣本）的快速驗證，為WGBS發(fā)現(xiàn)的重要DMRs提供經(jīng)濟可行的臨床轉(zhuǎn)化路徑。
功能關(guān)聯(lián)：TBS數(shù)據(jù)與qPCR表達(dá)數(shù)據(jù)精準(zhǔn)配對，建立甲基化-表達(dá)回歸模型，篩選出調(diào)控效能最強的CpG位點，為后續(xù)開發(fā)甲基化特異性引物用于MRD監(jiān)測提供靶點。
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