提高小鼠原代腎小球系膜細(xì)胞純度的步驟
提高小鼠原代腎小球系膜細(xì)胞純度的關(guān)鍵在于優(yōu)化分離、鑒定和培養(yǎng)流程。以下是具體方法：
一、優(yōu)化分離步驟
機(jī)械研磨與過濾
采用機(jī)械研磨法結(jié)合不同孔徑不銹鋼網(wǎng)篩過濾，可有效去除大塊組織和雜質(zhì)。
消化后使用70 μm與40 μm濾膜依次過濾，反向沖洗40 μm濾膜以收集更多細(xì)胞。
酶解法選擇
使用0.1%（1 mg/ml）II型膠原酶在37℃條件下振蕩消化40分鐘，可提高細(xì)胞活性和純度。
二、嚴(yán)格鑒定與篩選
α-SMA免疫熒光染色
α-SMA是系膜細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，陽(yáng)性染色可直觀反映細(xì)胞純度。
操作步驟：
細(xì)胞固定后，用α-SMA抗體孵育；
熒光標(biāo)記二抗染色，顯微鏡下觀察陽(yáng)性信號(hào)。
結(jié)蛋白（Desmin）免疫熒光染色
Desmin是系膜細(xì)胞的另一種標(biāo)志物，陽(yáng)性染色可輔助驗(yàn)證純度。
操作步驟與α-SMA染色類似，但需使用Desmin抗體。
三、優(yōu)化培養(yǎng)條件
培養(yǎng)基與環(huán)境
使用DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加10%胎牛血清和1%雙抗（青霉素/鏈霉素）。
培養(yǎng)條件：37℃、5% CO₂，濕度保持70%-80%。
傳代與凍存
細(xì)胞長(zhǎng)至80%-90%密度時(shí)，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化1-2分鐘，按1:2~1:5比例分瓶。
凍存液：90%血清+10% DMSO，液氮保存。
四、質(zhì)量控制與驗(yàn)證
無菌檢測(cè)
確保細(xì)胞不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌等污染。
純度標(biāo)準(zhǔn)
純度＞90%為合格，若低于此值需優(yōu)化分離或鑒定方法。
一、優(yōu)化分離步驟
機(jī)械研磨與過濾
采用機(jī)械研磨法結(jié)合不同孔徑不銹鋼網(wǎng)篩過濾，可有效去除大塊組織和雜質(zhì)。
消化后使用70 μm與40 μm濾膜依次過濾，反向沖洗40 μm濾膜以收集更多細(xì)胞。
酶解法選擇
使用0.1%（1 mg/ml）II型膠原酶在37℃條件下振蕩消化40分鐘，可提高細(xì)胞活性和純度。
二、嚴(yán)格鑒定與篩選
α-SMA免疫熒光染色
α-SMA是系膜細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，陽(yáng)性染色可直觀反映細(xì)胞純度。
操作步驟：
細(xì)胞固定后，用α-SMA抗體孵育；
熒光標(biāo)記二抗染色，顯微鏡下觀察陽(yáng)性信號(hào)。
結(jié)蛋白（Desmin）免疫熒光染色
Desmin是系膜細(xì)胞的另一種標(biāo)志物，陽(yáng)性染色可輔助驗(yàn)證純度。
操作步驟與α-SMA染色類似，但需使用Desmin抗體。
三、優(yōu)化培養(yǎng)條件
培養(yǎng)基與環(huán)境
使用DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加10%胎牛血清和1%雙抗（青霉素/鏈霉素）。
培養(yǎng)條件：37℃、5% CO₂，濕度保持70%-80%。
傳代與凍存
細(xì)胞長(zhǎng)至80%-90%密度時(shí)，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化1-2分鐘，按1:2~1:5比例分瓶。
凍存液：90%血清+10% DMSO，液氮保存。
四、質(zhì)量控制與驗(yàn)證
無菌檢測(cè)
確保細(xì)胞不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌等污染。
純度標(biāo)準(zhǔn)
純度＞90%為合格，若低于此值需優(yōu)化分離或鑒定方法。
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