D-螢光素鈉鹽D-luciferin sodium-MCE
D-螢光素鈉鹽D-luciferin sodium 是熒光素酶 (Luc) 的天然底物，對螢火蟲產(chǎn)生典型的黃綠光進(jìn)行催化。該反應(yīng)產(chǎn)生的 560 nm 化學(xué)發(fā)光在幾秒鐘內(nèi)達(dá)到峰值，當(dāng)?shù)孜餆晒馑剡^量時，光輸出與熒光素酶濃度成正比。熒光素酶 (luc) 基因是研究和活性分子篩選的常用報告基因。化學(xué)發(fā)光技術(shù)實(shí)際上是無背景的，使得 luc 報告基因成為檢測低水平基因表達(dá)的理想選擇。在標(biāo)準(zhǔn)熒光計數(shù)儀中可以可靠地測量到 0.02 pg 的熒光素酶。除了用于基因表達(dá)的外，熒光素酶還用于 ATP 的檢測。
MCE 的所有產(chǎn)品僅用作科學(xué)研究或藥證申報，我們不為任何個人用途提供產(chǎn)品和服務(wù)
生物活性
體外研究
1. 注意事項
a) D-螢光素鹽易溶于水性緩沖液 (pH 6.1-6.5)，溶解度最高可達(dá) 100 mM。儲備液可用不含 ATP 的水配制，并在 -20°C 下避光保存。游離酸必須用適當(dāng)?shù)膲A中和才能溶解。在較高的 pH 值下，熒光素會在堿催化下形成脫氫熒光素，并外消旋化為 L-異構(gòu)體。
b) D-熒光素可用于任何現(xiàn)有的報告分析或 ATP 分析系統(tǒng)。
c) 如果測試 ATP，請戴上手套并使用不含 ATP 的容器，以盡量減少所有可能的 ATP 污染源。僅使用無菌的無 ATP 水和試劑。使用高壓滅菌水制備所有試劑。
2. 實(shí)驗(yàn)方案
本方案僅提供一個指導(dǎo)，應(yīng)根據(jù)您的具體需要進(jìn)行修改。
以下方案是鉀和鉀的示例鈉鹽制備。它適用于大多數(shù)細(xì)胞類型和體內(nèi)動物使用。
2.1 體外生物發(fā)光圖像分析的示例方案
a) 在無菌水中制備 100 mM (100-200X) 熒光素原液。拌勻。立即使用，或一次性分裝，-20°C保存，避免凍融循環(huán)，避免光照。
b) 制備0.5-1 mM D-Luciferin工作液于pre-加熱的組織培養(yǎng)基。
c) 從培養(yǎng)的細(xì)胞中吸出培養(yǎng)基。
d) 向細(xì)胞中加入熒光素工作溶液，并在成像前將細(xì)胞在 37°C 下孵育 5-10 分鐘。
2.2 體內(nèi)生物發(fā)光圖像分析的示例方案
a) 在 DPBS 中制備 15 mg/mL 熒光素原液，不含 Mg2+ 和 Ca2+�；旌暇鶆�。
b) 過濾器通過 0.2 μM 過濾器對溶液進(jìn)行除菌。立即使用，或一次性分裝，并儲存在 -20°C，避免凍融循環(huán)，避免暴露在光線下。
c) 成像前 10-15 分鐘腹膜內(nèi) (ip) 注射熒光素在動物體重的 150 mg/kg (或 10 μL/g 熒光素原液) 下。
注意：應(yīng)對每個動物模型進(jìn)行熒光素動力學(xué)研究以確定峰值信號時間。
2.3 熒光素報告基因檢測的示例方案
a) 在無菌水中制備 100 mM 熒光素原液。立即使用，或一次性分裝，-20°C 保存，避免凍融循環(huán)，避免暴露在光線下。
b) 制備 1 mM 的 D-Luciferin 工作溶液和 3 mM ATP，1 mM DTT 和 15 mM MgSO4 在 25 mM Tricine 緩沖液 pH 7.8 中。
c) 將 5-10 μL 細(xì)胞裂解物移至微孔板中。使用裂解試劑或不含裂解物的緩沖液作為空白。
d) 根據(jù)制造商的說明用熒光素工作溶液灌注發(fā)光計。
e) 立即注入 200 μL 熒光素工作溶液，積分時間為 10 s.
體內(nèi)研究
使用螢火蟲熒光素酶 (Fluc) 作為報告基因和 D-熒光素作為底物的生物發(fā)光成像 (BLI) 是目前應(yīng)用最廣泛的技術(shù)。將總信號強(qiáng)度與 D-熒光素注射后的時間作圖，以生成時間-強(qiáng)度曲線。除了峰值信號外，D-熒光素注射后固定時間點(diǎn) (5、10、15 和 20 分鐘) 的信號被確定為峰值信號的替代信號。給定時間-強(qiáng)度曲線中的信號針對曲線中的峰值信號進(jìn)行歸一化，以表示 D-熒光素注射后的時間變化模式[3]。
注入 10 μL每克體重的 D-螢光素 (腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)) 儲備液：標(biāo)準(zhǔn) 150 mg/kg 注射的 20 g 小鼠通常約 200 μL。
解凍 D-螢光素 (鉀鹽或鈉鹽) 室溫并溶解在 dPBS (不含鈣或鎂) 中，最終濃度為 15 mg/mL。通過 5-10 mL 的無菌 H2O 潤濕 0.22 μM 過濾器并丟棄水。通過準(zhǔn)備好的 0.22 μM 注射器過濾器對 D-熒光素溶液進(jìn)行消毒。
注射入體內(nèi) 10-20 min (待光信號達(dá)到最強(qiáng)穩(wěn)定平臺期)，再進(jìn)行成像分析。
注意：建議對每只動物模型都需要建立熒光素酶動力學(xué)曲線，從而確定最高信號檢測時間和信號平臺期。熒光素注射注入小鼠體內(nèi)后，約 1 min 可擴(kuò)散到小鼠全身。
對于腹腔注射來講，擴(kuò)散較慢，開始發(fā)光較慢，持續(xù)發(fā)光時間較長。
對于熒光素的尾部靜脈注射，擴(kuò)散快，開始發(fā)光快，但發(fā)光持續(xù)時間較短。
動物給藥[3]
小鼠實(shí)驗(yàn)[3]
在接種HCT116-Luc細(xì)胞后第3、5、7、10、12、14、19、21、24和28天，使用冷卻式電荷耦合器件（CCD）相機(jī)系統(tǒng)（IVIS成像系統(tǒng)100）進(jìn)行活體生物發(fā)光成像（in vivo BLI）。小鼠于肩胛部皮下注射75 mg/kg的D-熒光素鈉溶于100 μL磷酸鹽緩沖液（PBS）中，隨后置于成像系統(tǒng)的密閉暗室中。從注射后5分鐘開始，以每分鐘1張圖像的頻率連續(xù)采集背側(cè)發(fā)光圖像，單次曝光時間為1秒，持續(xù)至注射后20分鐘。在第3天和第5天，數(shù)據(jù)采集延長至注射后40分鐘；在第7天延長至25分鐘，以適應(yīng)發(fā)光信號持續(xù)時間的延長。成像時設(shè)定像素合并（binning）為4，視野（field of view）為15 cm。
MCE未獨(dú)立驗(yàn)證上述方法的準(zhǔn)確性，僅供參考。
參考文獻(xiàn)
[3]. Inoue Y, et al. Timing of imaging after d-luciferin injection affects the longitudinal assessment of tumor growthusing in vivo bioluminescence imaging. Int J Biomed Imaging. 2010;2010:471408.
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生物活性
體外研究
1. 注意事項
a) D-螢光素鹽易溶于水性緩沖液 (pH 6.1-6.5)，溶解度最高可達(dá) 100 mM。儲備液可用不含 ATP 的水配制，并在 -20°C 下避光保存。游離酸必須用適當(dāng)?shù)膲A中和才能溶解。在較高的 pH 值下，熒光素會在堿催化下形成脫氫熒光素，并外消旋化為 L-異構(gòu)體。
b) D-熒光素可用于任何現(xiàn)有的報告分析或 ATP 分析系統(tǒng)。
c) 如果測試 ATP，請戴上手套并使用不含 ATP 的容器，以盡量減少所有可能的 ATP 污染源。僅使用無菌的無 ATP 水和試劑。使用高壓滅菌水制備所有試劑。
2. 實(shí)驗(yàn)方案
本方案僅提供一個指導(dǎo)，應(yīng)根據(jù)您的具體需要進(jìn)行修改。
以下方案是鉀和鉀的示例鈉鹽制備。它適用于大多數(shù)細(xì)胞類型和體內(nèi)動物使用。
2.1 體外生物發(fā)光圖像分析的示例方案
a) 在無菌水中制備 100 mM (100-200X) 熒光素原液。拌勻。立即使用，或一次性分裝，-20°C保存，避免凍融循環(huán)，避免光照。
b) 制備0.5-1 mM D-Luciferin工作液于pre-加熱的組織培養(yǎng)基。
c) 從培養(yǎng)的細(xì)胞中吸出培養(yǎng)基。
d) 向細(xì)胞中加入熒光素工作溶液，并在成像前將細(xì)胞在 37°C 下孵育 5-10 分鐘。
2.2 體內(nèi)生物發(fā)光圖像分析的示例方案
a) 在 DPBS 中制備 15 mg/mL 熒光素原液，不含 Mg2+ 和 Ca2+�；旌暇鶆�。
b) 過濾器通過 0.2 μM 過濾器對溶液進(jìn)行除菌。立即使用，或一次性分裝，并儲存在 -20°C，避免凍融循環(huán)，避免暴露在光線下。
c) 成像前 10-15 分鐘腹膜內(nèi) (ip) 注射熒光素在動物體重的 150 mg/kg (或 10 μL/g 熒光素原液) 下。
注意：應(yīng)對每個動物模型進(jìn)行熒光素動力學(xué)研究以確定峰值信號時間。
2.3 熒光素報告基因檢測的示例方案
a) 在無菌水中制備 100 mM 熒光素原液。立即使用，或一次性分裝，-20°C 保存，避免凍融循環(huán)，避免暴露在光線下。
b) 制備 1 mM 的 D-Luciferin 工作溶液和 3 mM ATP，1 mM DTT 和 15 mM MgSO4 在 25 mM Tricine 緩沖液 pH 7.8 中。
c) 將 5-10 μL 細(xì)胞裂解物移至微孔板中。使用裂解試劑或不含裂解物的緩沖液作為空白。
d) 根據(jù)制造商的說明用熒光素工作溶液灌注發(fā)光計。
e) 立即注入 200 μL 熒光素工作溶液，積分時間為 10 s.
體內(nèi)研究
使用螢火蟲熒光素酶 (Fluc) 作為報告基因和 D-熒光素作為底物的生物發(fā)光成像 (BLI) 是目前應(yīng)用最廣泛的技術(shù)。將總信號強(qiáng)度與 D-熒光素注射后的時間作圖，以生成時間-強(qiáng)度曲線。除了峰值信號外，D-熒光素注射后固定時間點(diǎn) (5、10、15 和 20 分鐘) 的信號被確定為峰值信號的替代信號。給定時間-強(qiáng)度曲線中的信號針對曲線中的峰值信號進(jìn)行歸一化，以表示 D-熒光素注射后的時間變化模式[3]。
注入 10 μL每克體重的 D-螢光素 (腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)) 儲備液：標(biāo)準(zhǔn) 150 mg/kg 注射的 20 g 小鼠通常約 200 μL。
解凍 D-螢光素 (鉀鹽或鈉鹽) 室溫并溶解在 dPBS (不含鈣或鎂) 中，最終濃度為 15 mg/mL。通過 5-10 mL 的無菌 H2O 潤濕 0.22 μM 過濾器并丟棄水。通過準(zhǔn)備好的 0.22 μM 注射器過濾器對 D-熒光素溶液進(jìn)行消毒。
注射入體內(nèi) 10-20 min (待光信號達(dá)到最強(qiáng)穩(wěn)定平臺期)，再進(jìn)行成像分析。
注意：建議對每只動物模型都需要建立熒光素酶動力學(xué)曲線，從而確定最高信號檢測時間和信號平臺期。熒光素注射注入小鼠體內(nèi)后，約 1 min 可擴(kuò)散到小鼠全身。
對于腹腔注射來講，擴(kuò)散較慢，開始發(fā)光較慢，持續(xù)發(fā)光時間較長。
對于熒光素的尾部靜脈注射，擴(kuò)散快，開始發(fā)光快，但發(fā)光持續(xù)時間較短。
動物給藥[3]
小鼠實(shí)驗(yàn)[3]
在接種HCT116-Luc細(xì)胞后第3、5、7、10、12、14、19、21、24和28天，使用冷卻式電荷耦合器件（CCD）相機(jī)系統(tǒng)（IVIS成像系統(tǒng)100）進(jìn)行活體生物發(fā)光成像（in vivo BLI）。小鼠于肩胛部皮下注射75 mg/kg的D-熒光素鈉溶于100 μL磷酸鹽緩沖液（PBS）中，隨后置于成像系統(tǒng)的密閉暗室中。從注射后5分鐘開始，以每分鐘1張圖像的頻率連續(xù)采集背側(cè)發(fā)光圖像，單次曝光時間為1秒，持續(xù)至注射后20分鐘。在第3天和第5天，數(shù)據(jù)采集延長至注射后40分鐘；在第7天延長至25分鐘，以適應(yīng)發(fā)光信號持續(xù)時間的延長。成像時設(shè)定像素合并（binning）為4，視野（field of view）為15 cm。
MCE未獨(dú)立驗(yàn)證上述方法的準(zhǔn)確性，僅供參考。
參考文獻(xiàn)
[3]. Inoue Y, et al. Timing of imaging after d-luciferin injection affects the longitudinal assessment of tumor growthusing in vivo bioluminescence imaging. Int J Biomed Imaging. 2010;2010:471408.
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