細(xì)胞消化原理以及難消化細(xì)胞解決方案
當(dāng)細(xì)胞達(dá)到匯合80-90%時(shí)，必須對(duì)其進(jìn)行傳代培養(yǎng)或傳代。未能傳代培養(yǎng)匯合細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致有絲分裂指數(shù)降低并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。傳代培養(yǎng)的第一步是通過(guò)胰蛋白酶消化或機(jī)械手段將細(xì)胞從原代培養(yǎng)容器表面分離。小伙伴們?cè)诮o貼壁細(xì)胞傳代的時(shí)候有沒(méi)有遇到細(xì)胞消化不下來(lái)的情況呢？有時(shí)候等了10分鐘甚至20分鐘細(xì)胞仍不動(dòng)，繼續(xù)等待怕消化過(guò)度，暴力吹下又怕對(duì)細(xì)胞造成機(jī)械損傷，可謂進(jìn)退兩難。我們先來(lái)了解下消化的作用機(jī)制：
一、消化作用的分子基礎(chǔ)
1.胰酶的核心作用機(jī)制
胰蛋白酶作為絲氨酸蛋白酶，特異性切割精氨酸和賴(lài)氨酸的羧基端肽鍵，通過(guò)水解作用破壞以下關(guān)鍵結(jié)構(gòu)：
細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）：降解纖連蛋白、層粘連蛋白等貼附支架蛋白；
細(xì)胞間連接蛋白：切割鈣黏蛋白和整合素，解除細(xì)胞-基質(zhì)及細(xì)胞-細(xì)胞間的黏附。
輔助試劑EDTA通過(guò)螯合Ca²⁺/Mg²⁺離子，削弱整合素與ECM的結(jié)合，提升胰酶效率。
2.離子螯合劑的協(xié)同效應(yīng)
0.02% EDTA通過(guò)剝奪細(xì)胞表面依賴(lài)鈣/鎂離子的黏附蛋白（如橋粒、鈣黏著蛋白），使細(xì)胞連接失活而不損傷膜蛋白結(jié)構(gòu)，適用于表面分子檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。
二、消化過(guò)程的分階段動(dòng)態(tài)變化
1.初始裂解階段
胰酶滲透細(xì)胞層，切割ECM蛋白，細(xì)胞邊緣開(kāi)始卷曲，貼附力下降；
2.連接破壞階段
鈣黏蛋白降解導(dǎo)致細(xì)胞間連接松開(kāi)，單層細(xì)胞分裂為小片狀；
3.完全脫落階段
細(xì)胞形態(tài)由鋪展轉(zhuǎn)為圓形，最終脫離培養(yǎng)表面（需37℃恒溫加速反應(yīng)）。
三、終止反應(yīng)的生化原理
血清終止法：含血清培養(yǎng)基中的α-1抗胰蛋白酶可不可逆抑制胰酶活性；
清洗終止法：PBS沖洗去除殘留胰酶，避免過(guò)度消化損傷細(xì)胞膜受體。
以下總結(jié)了細(xì)胞難消化的原因，以及對(duì)應(yīng)的處理方式：
1.細(xì)胞貼壁緊
不同種類(lèi)的細(xì)胞貼壁的松緊程度是不一樣的，比如293系列細(xì)胞貼壁很松，是晃一晃就可能掉下來(lái)的程度。而MCF10A、IBMDM等巨噬細(xì)胞系貼壁很緊，可能需要消化5-10min甚至更久才能脫落。在培養(yǎng)一株細(xì)胞之前，可以問(wèn)問(wèn)有經(jīng)驗(yàn)的科研人員或者上網(wǎng)查資料或者從細(xì)胞來(lái)源處確認(rèn)這株細(xì)胞大概消化多久，才能更好完成消化步驟使細(xì)胞保持最佳狀態(tài)。
還有不規(guī)則形態(tài)細(xì)胞存在更多貼附位點(diǎn)，需增加胰酶用量至完全覆蓋細(xì)胞層才能達(dá)到消化的目的。如：
解決方案：若您培養(yǎng)的細(xì)胞貼壁較緊，參考以下步驟1.增加消化時(shí)間，常規(guī)細(xì)胞消化時(shí)間為1-3min，難消化的細(xì)胞需要5-15min甚至更長(zhǎng)。 2.提高胰酶的濃度，常用濃度為0.25%，可提高到0.5%；3.加入足量的胰酶至沒(méi)過(guò)細(xì)胞，37℃消化；使用含有EDTA的胰酶，具體請(qǐng)以鏡下觀察到細(xì)胞變圓脫落為準(zhǔn)。（常用的培養(yǎng)器皿推薦胰酶添加量）
小技巧：在消化貼壁較緊的細(xì)胞有個(gè)小技巧，就是消化到細(xì)胞要脫落的時(shí)候先不終止，先吸胰酶輕輕吹下細(xì)胞，大部分細(xì)胞脫落后再加終止液。貼壁太強(qiáng)的細(xì)胞，先加終止有時(shí)候會(huì)很快貼壁回去導(dǎo)致消化其實(shí)細(xì)胞已經(jīng)要脫落了，但一加終止液就貼回去的情況。
注:如還有部分細(xì)胞未消化下來(lái)，可采用分步消化:
① 準(zhǔn)備一個(gè)無(wú)菌的 15ml 離心管，加入 2ml含 10%FBS 的完全培養(yǎng)基;
② 將消化下來(lái)的細(xì)胞吸入①中的離心管內(nèi)中和(避免吹打);
③ 向之前消化的培養(yǎng)瓶中加入 1ml 胰酶繼續(xù)消化 2min 左右，輕拍培養(yǎng)瓶，95%左右細(xì)胞脫落后加入 2ml含 10%FBS 的完全培養(yǎng)基中和，中和后的細(xì)胞懸液移入①中的離心管內(nèi)。
比如：bEnd.3細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)越難消化，培養(yǎng)4d傳代，一般消化3~5 min；培養(yǎng)7d傳代，一般消化5~10 min。具體消化時(shí)間以顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)為準(zhǔn)。
2.有殘留血清
血清中的某些蛋白質(zhì)（如α1-抗胰蛋白酶，α2-巨球蛋白）對(duì)蛋白酶有強(qiáng)烈的抑制作用。如果PBS清洗不徹底，胰酶將不能發(fā)揮作用。
解決方案：若在消化途中發(fā)現(xiàn)因清洗不徹底而無(wú)法消化下來(lái)，吸去培養(yǎng)器皿中的胰酶（如果已有部分細(xì)胞脫落，將已脫落細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管），向培養(yǎng)器皿中加入足量PBS重新潤(rùn)洗30s，棄去PBS再加入新的胰酶來(lái)重新消化。
3.胰酶量過(guò)少/濃度低/消化溫度低
有的小伙伴習(xí)慣用胰酶清洗細(xì)胞后去掉大部分胰酶，用剩余的胰酶繼續(xù)消化，這對(duì)于貼壁松的細(xì)胞是可以的，但該方法并不適用于貼壁緊的細(xì)胞。胰酶量太少無(wú)法將貼壁緊的細(xì)胞消化徹底。胰酶的最適溫度是37℃，有一種常用策略是室溫消化，當(dāng)溫度低于37℃時(shí)胰酶活性低，室溫環(huán)境消化還可以放在顯微鏡下邊看邊消化，更容易把握消化進(jìn)度。但仍然需要注意這適用于貼壁較松且比較脆弱的細(xì)胞，對(duì)于貼壁緊的細(xì)胞室溫下是很難消化下來(lái)的，甚至可能因消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生傷害。常見(jiàn)的胰酶濃度有0.125%，0.25%和0.5%。常規(guī)細(xì)胞系多用0.25%胰酶，而對(duì)胰酶敏感的較脆弱的細(xì)胞可使用0.125%胰酶消化。應(yīng)根據(jù)細(xì)胞的貼壁特性和胰酶耐受程度，使用不同濃度的胰酶。
解決方案：根據(jù)細(xì)胞貼壁特性選擇合適的胰酶使用量、濃度和消化溫度。
4.胰酶失活
胰酶開(kāi)封久了活性會(huì)降低甚至徹底失活，所以小伙伴們可以根據(jù)需要將開(kāi)封的胰酶分裝到離心管中，將暫時(shí)不用的部分放在-20℃冰箱冷凍，放在2-8℃冷藏的胰酶也要盡早使用完畢哦。
解決方案：若發(fā)現(xiàn)胰酶開(kāi)封太久，建議使用新的胰酶進(jìn)行消化。
5.胰酶品牌差異
胰酶通常來(lái)自牛或豬的胰腺，不同廠家的提取加工工藝不同，所生產(chǎn)的胰酶消化時(shí)間差別較大。
解決方案：從不同廠家獲取胰酶試用裝，找到最適合自己細(xì)胞的胰酶品牌。
6.細(xì)胞密度過(guò)大或長(zhǎng)時(shí)間不傳代
細(xì)胞密度過(guò)大，造成細(xì)胞擁擠或者堆疊時(shí)細(xì)胞將變得更難消化。另外，細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)不傳代也有可能使細(xì)胞貼壁變緊。
解決方案：若出現(xiàn)上述情況，可增加胰酶的用量，并適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間，直到細(xì)胞能夠脫落。
7. 增加胰酶的用量，延長(zhǎng)消化時(shí)間，用常規(guī)方法細(xì)胞仍消化不下來(lái)，如何處理？
解決方案：若出現(xiàn)上述情況，先判斷細(xì)胞消化前的狀態(tài)是否正常，若細(xì)胞形態(tài)異常，出現(xiàn)老化或分化現(xiàn)象，貼壁就會(huì)異常牢固，用常規(guī)方法消化不下來(lái)�？蓢L試用刮刀將細(xì)胞刮下來(lái)，離心傳代后觀察細(xì)胞狀態(tài)，若細(xì)胞形態(tài)狀態(tài)仍異常，建議丟棄，重新復(fù)蘇其他批次。
一、消化作用的分子基礎(chǔ)
1.胰酶的核心作用機(jī)制
胰蛋白酶作為絲氨酸蛋白酶，特異性切割精氨酸和賴(lài)氨酸的羧基端肽鍵，通過(guò)水解作用破壞以下關(guān)鍵結(jié)構(gòu)：
細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）：降解纖連蛋白、層粘連蛋白等貼附支架蛋白；
細(xì)胞間連接蛋白：切割鈣黏蛋白和整合素，解除細(xì)胞-基質(zhì)及細(xì)胞-細(xì)胞間的黏附。
輔助試劑EDTA通過(guò)螯合Ca²⁺/Mg²⁺離子，削弱整合素與ECM的結(jié)合，提升胰酶效率。
2.離子螯合劑的協(xié)同效應(yīng)
0.02% EDTA通過(guò)剝奪細(xì)胞表面依賴(lài)鈣/鎂離子的黏附蛋白（如橋粒、鈣黏著蛋白），使細(xì)胞連接失活而不損傷膜蛋白結(jié)構(gòu)，適用于表面分子檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。
二、消化過(guò)程的分階段動(dòng)態(tài)變化
1.初始裂解階段
胰酶滲透細(xì)胞層，切割ECM蛋白，細(xì)胞邊緣開(kāi)始卷曲，貼附力下降；
2.連接破壞階段
鈣黏蛋白降解導(dǎo)致細(xì)胞間連接松開(kāi)，單層細(xì)胞分裂為小片狀；
3.完全脫落階段
細(xì)胞形態(tài)由鋪展轉(zhuǎn)為圓形，最終脫離培養(yǎng)表面（需37℃恒溫加速反應(yīng)）。
三、終止反應(yīng)的生化原理
血清終止法：含血清培養(yǎng)基中的α-1抗胰蛋白酶可不可逆抑制胰酶活性；
清洗終止法：PBS沖洗去除殘留胰酶，避免過(guò)度消化損傷細(xì)胞膜受體。
以下總結(jié)了細(xì)胞難消化的原因，以及對(duì)應(yīng)的處理方式：
1.細(xì)胞貼壁緊
不同種類(lèi)的細(xì)胞貼壁的松緊程度是不一樣的，比如293系列細(xì)胞貼壁很松，是晃一晃就可能掉下來(lái)的程度。而MCF10A、IBMDM等巨噬細(xì)胞系貼壁很緊，可能需要消化5-10min甚至更久才能脫落。在培養(yǎng)一株細(xì)胞之前，可以問(wèn)問(wèn)有經(jīng)驗(yàn)的科研人員或者上網(wǎng)查資料或者從細(xì)胞來(lái)源處確認(rèn)這株細(xì)胞大概消化多久，才能更好完成消化步驟使細(xì)胞保持最佳狀態(tài)。
還有不規(guī)則形態(tài)細(xì)胞存在更多貼附位點(diǎn)，需增加胰酶用量至完全覆蓋細(xì)胞層才能達(dá)到消化的目的。如：
| 細(xì)胞類(lèi)型 | 主要粘附蛋白 | 消化難度 |
| 293T | 纖連蛋白 | ★☆☆☆☆ |
| MCF-7 | 層粘連蛋白+膠原 | ★★★☆☆ |
| 原代肝細(xì)胞 | 整合素+E-鈣粘蛋白 | ★★★★★ |
| 培養(yǎng)瓶類(lèi)型 | 胰酶濃度/添加量 |
| 6孔板（每孔） | 500ul （0.25%含EDTA胰酶） |
| T25瓶 | 1ml （0.25%含EDTA胰酶） |
| T75瓶 | 2.5 ml （0.25%含EDTA胰酶） |
| 10cm皿 | 2 ml （0.25%含EDTA胰酶） |
注:如還有部分細(xì)胞未消化下來(lái)，可采用分步消化:
① 準(zhǔn)備一個(gè)無(wú)菌的 15ml 離心管，加入 2ml含 10%FBS 的完全培養(yǎng)基;
② 將消化下來(lái)的細(xì)胞吸入①中的離心管內(nèi)中和(避免吹打);
③ 向之前消化的培養(yǎng)瓶中加入 1ml 胰酶繼續(xù)消化 2min 左右，輕拍培養(yǎng)瓶，95%左右細(xì)胞脫落后加入 2ml含 10%FBS 的完全培養(yǎng)基中和，中和后的細(xì)胞懸液移入①中的離心管內(nèi)。
比如：bEnd.3細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)越難消化，培養(yǎng)4d傳代，一般消化3~5 min；培養(yǎng)7d傳代，一般消化5~10 min。具體消化時(shí)間以顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)為準(zhǔn)。
2.有殘留血清
血清中的某些蛋白質(zhì)（如α1-抗胰蛋白酶，α2-巨球蛋白）對(duì)蛋白酶有強(qiáng)烈的抑制作用。如果PBS清洗不徹底，胰酶將不能發(fā)揮作用。
解決方案：若在消化途中發(fā)現(xiàn)因清洗不徹底而無(wú)法消化下來(lái)，吸去培養(yǎng)器皿中的胰酶（如果已有部分細(xì)胞脫落，將已脫落細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管），向培養(yǎng)器皿中加入足量PBS重新潤(rùn)洗30s，棄去PBS再加入新的胰酶來(lái)重新消化。
3.胰酶量過(guò)少/濃度低/消化溫度低
有的小伙伴習(xí)慣用胰酶清洗細(xì)胞后去掉大部分胰酶，用剩余的胰酶繼續(xù)消化，這對(duì)于貼壁松的細(xì)胞是可以的，但該方法并不適用于貼壁緊的細(xì)胞。胰酶量太少無(wú)法將貼壁緊的細(xì)胞消化徹底。胰酶的最適溫度是37℃，有一種常用策略是室溫消化，當(dāng)溫度低于37℃時(shí)胰酶活性低，室溫環(huán)境消化還可以放在顯微鏡下邊看邊消化，更容易把握消化進(jìn)度。但仍然需要注意這適用于貼壁較松且比較脆弱的細(xì)胞，對(duì)于貼壁緊的細(xì)胞室溫下是很難消化下來(lái)的，甚至可能因消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生傷害。常見(jiàn)的胰酶濃度有0.125%，0.25%和0.5%。常規(guī)細(xì)胞系多用0.25%胰酶，而對(duì)胰酶敏感的較脆弱的細(xì)胞可使用0.125%胰酶消化。應(yīng)根據(jù)細(xì)胞的貼壁特性和胰酶耐受程度，使用不同濃度的胰酶。
解決方案：根據(jù)細(xì)胞貼壁特性選擇合適的胰酶使用量、濃度和消化溫度。
4.胰酶失活
胰酶開(kāi)封久了活性會(huì)降低甚至徹底失活，所以小伙伴們可以根據(jù)需要將開(kāi)封的胰酶分裝到離心管中，將暫時(shí)不用的部分放在-20℃冰箱冷凍，放在2-8℃冷藏的胰酶也要盡早使用完畢哦。
解決方案：若發(fā)現(xiàn)胰酶開(kāi)封太久，建議使用新的胰酶進(jìn)行消化。
5.胰酶品牌差異
胰酶通常來(lái)自牛或豬的胰腺，不同廠家的提取加工工藝不同，所生產(chǎn)的胰酶消化時(shí)間差別較大。
解決方案：從不同廠家獲取胰酶試用裝，找到最適合自己細(xì)胞的胰酶品牌。
6.細(xì)胞密度過(guò)大或長(zhǎng)時(shí)間不傳代
細(xì)胞密度過(guò)大，造成細(xì)胞擁擠或者堆疊時(shí)細(xì)胞將變得更難消化。另外，細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)不傳代也有可能使細(xì)胞貼壁變緊。
解決方案：若出現(xiàn)上述情況，可增加胰酶的用量，并適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間，直到細(xì)胞能夠脫落。
7. 增加胰酶的用量，延長(zhǎng)消化時(shí)間，用常規(guī)方法細(xì)胞仍消化不下來(lái)，如何處理？
解決方案：若出現(xiàn)上述情況，先判斷細(xì)胞消化前的狀態(tài)是否正常，若細(xì)胞形態(tài)異常，出現(xiàn)老化或分化現(xiàn)象，貼壁就會(huì)異常牢固，用常規(guī)方法消化不下來(lái)�？蓢L試用刮刀將細(xì)胞刮下來(lái)，離心傳代后觀察細(xì)胞狀態(tài)，若細(xì)胞形態(tài)狀態(tài)仍異常，建議丟棄，重新復(fù)蘇其他批次。
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