可消化和抗性淀粉檢測(cè)K-DSTRS的原理和操作步驟
可消化和抗性淀粉檢測(cè)（40次檢測(cè)）K-DSTRS
簡(jiǎn)介：
專業(yè)用語(yǔ)，快速消化淀粉（RDS）、緩慢消化淀粉（SDS）和 Englyst1等人于1992年引入了抗淀粉酶淀粉（RS），以反映 體內(nèi)淀粉消化率。他們的工作，以及Wahlquist2等人的工作，Jenkins等人3 其他研究表明，食物的生理形態(tài)和淀粉的性質(zhì)是 淀粉消化速率的主要決定因素。在這段時(shí)間里，它 研究還表明，“可消化”淀粉可以同時(shí)水解和吸收 作為單糖，但有些淀粉在人體內(nèi)難以消化 腸。Englyst等人。4 在他們的研究中首次觀察到抗淀粉酶淀粉（RS）開(kāi)發(fā)了一種非淀粉多糖（NSP）的測(cè)量方法。這些作者認(rèn)為NSP是膳食纖維（DF）的最佳測(cè)量方法，因此所有淀粉都是在NSP的測(cè)量中溶解（使用DMSO）并水解去除。最近，食品法典委員會(huì)5發(fā)布了膳食纖維的定義包括耐消化淀粉（RS）和是否納入不易消化淀粉的決定低聚糖（NDO）留給各個(gè)國(guó)家。在RINTDF程序中，與胰腺α-淀粉酶/淀粉葡萄糖苷酶（PAA/AMG）孵育的時(shí)間設(shè)定為4小時(shí)，并優(yōu)化PAA和AMG的濃度，以確保一組純淀粉和含淀粉食品樣本的RS值與回腸造口術(shù)數(shù)據(jù)相匹配。最終，這兩種酶的濃度都達(dá)到飽和，這與Englyst等人1在其可消化淀粉方法中描述的工作一致。主要區(qū)別在于，在RINTDF程序中，使用了高度純化的即用型酶。
文獻(xiàn)表明，食物在人體小腸中的平均停留時(shí)間為4±1小時(shí)。因此，這被選為RINTDF程序中PAA/AMG的孵育時(shí)間。在Englyst等人1的可消化碳水化合物程序中，在20分鐘時(shí)取出樣品以測(cè)定快速消化淀粉（RDS），在120分鐘時(shí)取出緩慢消化淀粉（SDS），剩余的淀粉被定義為抗性淀粉（RS）。由于食物在小腸中的停留時(shí)間約為4小時(shí)，因此RS應(yīng)定義為在這段時(shí)間內(nèi)孵化后剩余的淀粉。我們現(xiàn)在引入一個(gè)新術(shù)語(yǔ)“總可消化淀粉（TDS）”來(lái)表示在4小時(shí)培養(yǎng)過(guò)程中水解的淀粉。因此，在當(dāng)前的測(cè)定方案中，在4小時(shí)時(shí)從培養(yǎng)混合物中取出額外的樣品以測(cè)量TDS。
抗性淀粉是樣品與PAA/AMG孵育4小時(shí)后剩余的淀粉。在目前的方法中，描述了RDS、SDS、TDS和RS的測(cè)量程序。這種方法適用于所有樣品。
原理：
根據(jù)用于在37°C下連續(xù)攪拌測(cè)量膳食纖維的程序（K-RINTDF；AOAC方法2017.16/2022.01），將純淀粉或含淀粉樣品與胰腺α-淀粉酶和淀粉葡萄糖苷酶（PAA/AMG）的混合物在pH 6.0的馬來(lái)酸鹽緩沖液中溫育4小時(shí)。在20分鐘（測(cè)量RDS）、120分鐘（測(cè)量SDS；SDS=120分鐘的淀粉值-20分鐘的淀粉價(jià)值）和240分鐘（測(cè)量TDS和RS）時(shí)去除反應(yīng)溶液的等分試樣。對(duì)于RDS、SDS和TDS，在攪拌懸浮液的同時(shí)取出1.0 mL等分試樣，并將其轉(zhuǎn)移到20 mL 50 mM乙酸中（以終止反應(yīng)）。將這些溶液充分混合，將0.1 mL等分試樣與0.1 mL AMG（100 U/mL）一起孵育，以將剩余的微量麥芽糖水解為葡萄糖，用GOPOD試劑測(cè)量。為了測(cè)量抗性淀粉（RS），在240分鐘（4小時(shí)）后從攪拌溶液中取出4毫升等分試樣，加入等體積的IMS中并充分混合。將樣品離心，用乙醇水溶液洗滌顆粒以去除游離葡萄糖，然后懸浮在氫氧化鈉中以溶解RS。溶液被中和，淀粉用AMG水解為葡萄糖，用GOPOD試劑測(cè)量葡萄糖（見(jiàn)圖1）。
用0.5 ml乙醇濕潤(rùn)樣品（0.5 g），在含有2 mM CaCl的20 ml馬來(lái)酸鈉緩沖液（50 mM，pH 6.0）中于37°C下與2 KU PAA和0.85 KU AMG一起孵育，并以170 rpm攪拌。
以不同的時(shí)間間隔取出等分試樣（1.0 mL），加入20.0 mL 50 mM乙酸以終止反應(yīng)（稀釋21倍）。
20分鐘RDS時(shí)1.0毫升
120分鐘時(shí)1.0 mL-$DS（SDS=120分鐘時(shí)的值，20分鐘時(shí)的數(shù)值）
240分鐘TDS（和可用碳水化合物）為1.0 mL
240分鐘時(shí)4.0 mL+4.0 mL耐乙醇淀粉
取出等分試樣（0.1 mL，一式兩份）與AMG一起孵育，并使用GOPOD試劑分析葡萄糖。
圖1. 根據(jù)方法1測(cè)量淀粉和食品樣品中RDS、SDS、TDS和RS的程序。
適用性和準(zhǔn)確性：
該方法適用于含有>2%w/w可消化淀粉（DS）或抗性淀粉（RS）的樣品。使用這些樣品，通�？梢赃_(dá)到±5%的標(biāo)準(zhǔn)誤差。DS或RS含量<2%w/w的樣品誤差更大。
套件：
可提供適用于進(jìn)行160次測(cè)定的試劑盒（RDS、SDS、TDS和RS各40次或各種其他組合）。試劑盒包含完整的檢測(cè)方法以及：
瓶1：純化PAA（40KU/g）和AMG（17KU/g）的混合物；5.2克。
密封儲(chǔ)存，在-10°C下干燥。有效期見(jiàn)單獨(dú)標(biāo)簽。
注意：有關(guān)本產(chǎn)品的適當(dāng)處理，請(qǐng)參閱SDS。
瓶2：pH 4.5和40°C下的淀粉糖苷酶[8 mL，3300 U/mL在可溶性淀粉上（或200 U/mL在對(duì)硝基苯β-麥芽糖苷上）]。
在4°C下儲(chǔ)存。有效期見(jiàn)單獨(dú)標(biāo)簽。
瓶3: GOPOD試劑緩沖液（50 mL，pH 7.4）。對(duì)羥基苯甲酸和疊氮化鈉（0.09%w/v）。
在4°C下儲(chǔ)存。有效期見(jiàn)單獨(dú)標(biāo)簽。
瓶4: GOPOD試劑酶。葡萄糖氧化酶加過(guò)氧化物酶和4-氨基安替比林。凍干粉。
儲(chǔ)存溫度低于-10°C。有效期見(jiàn)單獨(dú)標(biāo)簽。
瓶5: 在0.2%（w/v）苯甲酸中的D-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（5 mL，1.0 mg/mL）。
在室溫下密封儲(chǔ)存。有效期見(jiàn)單獨(dú)標(biāo)簽。
瓶6：可消化/抗性淀粉對(duì)照（約10克）。標(biāo)簽上顯示的可消化淀粉和抗性淀粉含量。
A.試劑溶液的制備
1.PAA/AMG儲(chǔ)備溶液。--PAA（4KU/5mL）加AMG（1.7KU/5 mL）。在使用前，將0.5 g PAA/AMG粉末混合物（瓶1）加入25 mL緩沖液[B（a）]（馬來(lái)酸鈉緩沖液50 mM，pH 6.0加2 mM CaCl2，制備方法見(jiàn)第4頁(yè)）中，在磁力攪拌器上攪拌5分鐘。使用時(shí)在冰上儲(chǔ)存。制備后4小時(shí)內(nèi)使用。這是解決方案1（PAA/AMG庫(kù)存解決方案）。
注意：硫酸銨懸浮液的制備方法如下：在通風(fēng)櫥的磁力攪拌器上，在100毫升燒杯中，將2.5克瓶子1（PAA 40 KU/g加AMG 17 KU/g）逐漸加入35毫升冷蒸餾水中，攪拌至酶完全溶解（約5分鐘）。加入17克顆粒狀硫酸銨，攪拌溶解。用硫酸銨溶液[B（f）]將體積調(diào)節(jié)至50毫升（制備方法見(jiàn)第5頁(yè)）。在4°C下穩(wěn)定≥3個(gè)月。
2a. AMG.使用隨附的瓶子2（淀粉葡萄糖苷酶）中的內(nèi)容物。
2b. 稀釋AMG。將1 mL瓶2的內(nèi)容物加入30 mL緩沖液[B（e）]（100 mM醋酸鈉緩沖液pH 4.5，制備方法見(jiàn)第5頁(yè)）�；旌暇鶆�，在13毫米聚丙烯管[C（t）]中分成約10毫升的等分試樣，在使用之間儲(chǔ)存在-10°C以下。這是溶液2（稀釋AMG（~110 U/mL））。
3. 用蒸餾水將GOPOD試劑緩沖瓶中的內(nèi)容物稀釋至1升。這是解決方案3。立即使用。
5.使用提供的瓶子5中的內(nèi)容物。
6.使用隨附的瓶子6中的內(nèi)容物。
B.試劑（未提供）：
a. 馬來(lái)酸鈉緩沖液50 mM，pH 6.0加2 mM CaCl2。--將11.6 g馬來(lái)酸溶解在1600 mL去離子水中，用4 M（160 g/L）NaOH溶液將pH調(diào)節(jié)至6.0。加入0.6 g二水合氯化鈣（CaCl2·2H2O），溶解并調(diào)節(jié)體積至2 L。在4°C下儲(chǔ)存在密封良好的Duran®瓶中。這是緩沖區(qū)[B（a）]。
b. 乙酸溶液，50 mM。--向1 L容量瓶中加入2.9 mL冰醋酸（SigmaW200611-1KG-K；1.05 g/mL）。用去離子水稀釋至1 L，并儲(chǔ)存在4°C的Duran瓶中。
c. 氫氧化鈉溶液，1.7 M。——將68 g氫氧化鈉加入通風(fēng)櫥中的800 mL蒸餾水中，攪拌溶解。用蒸餾水將體積調(diào)節(jié)至1 L，并儲(chǔ)存在4°c的Duran®瓶中。
d. 醋酸鈉緩沖液，1.0 M，pH 3.8加氯化鈣（5 mM）將57.0 mL冰醋酸（1.05 g/mL）加入800 mL蒸餾水中，用4 M氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至3.8。加入0.74克二水合氯化鈣并溶解。用蒸餾水將體積調(diào)節(jié)至1 L，并儲(chǔ)存在4°C的Duran®瓶中。這是緩沖區(qū)[B（d）]。
e. 100 mM pH 4.5的醋酸鈉緩沖液。將5.7 mL冰醋酸（1.05 g/mL）加入800 mL蒸餾水中，用1 M氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至4.5。用蒸餾水將體積調(diào)節(jié)至1 L，并儲(chǔ)存在4°C的Duran®瓶中。這是緩沖區(qū)[B（e）]。
f. 50%w/v.硫酸銨溶液——將50克硫酸銨加入80毫升蒸餾水中，攪拌溶解。用蒸餾水將體積調(diào)節(jié)至100毫升。儲(chǔ)存在4°C的杜蘭瓶中。
g. 50%v/v乙醇水溶液和50%v/v IMS水溶液——向500 mL蒸餾水中加入500 mL乙醇（95%v/v）或工業(yè)甲基化酒精（IMS，95%v/v）。室溫下儲(chǔ)存在1L杜蘭瓶中。
C. 所需設(shè)備：
a. 研磨機(jī)。--離心式，帶12齒轉(zhuǎn)子和0.5毫米篩網(wǎng)，或類似裝置�；蛘撸L(fēng)研磨機(jī)可用于小型測(cè)試實(shí)驗(yàn)室樣品，前提是研磨機(jī)有足夠的空氣流量或其他冷卻方式，以避免樣品過(guò)熱。
b. 絞肉機(jī) --手動(dòng)或電動(dòng)，配備4.5毫米屏幕。
c. 水浴。--容納2毫克Mixdrive 15®潛水磁力攪拌器，帶浸沒(méi)式加熱器（如Lauda Alpha®）。（圖2所示的設(shè)置是最佳的）。
d. 潛水磁力攪拌器。--2mag Mixdrive 15®潛水磁力攪拌器。
e. 分光光度計(jì)--其能夠在510nm下操作、優(yōu)選地裝配有流通電池（10mm路徑長(zhǎng)度）。
f. 分析天平。--0.1mg可讀性、準(zhǔn)確性和精密度。
g. 臺(tái)式離心機(jī)--能夠容納101 x 16.5 mm的聚丙烯管，額定轉(zhuǎn)速約為3250 rcf（~4000 rpm），例如Sigma實(shí)驗(yàn)室離心機(jī)4-15，編號(hào)10730。
h. 冷凍干燥機(jī)--Virtis Genesis®25XL或類似產(chǎn)品。英國(guó)溫徹斯特生物制藥廠生物制藥工藝系統(tǒng)。
I. 微型離心機(jī)--轉(zhuǎn)速可達(dá)13000轉(zhuǎn)/分。
j. 一次性2.0 mL聚丙烯微量離心管例如Cat: Sarstedt。地址：72.691 Sarstedt有限公司，Drinagh，Ireland。
k. pH計(jì)。--例如 Seven Easy pH Mettler Toledo.。
l. 渦流混合器。--例如Daihan Scientific VM10。
m. 水分分析儀。--例如OHAUS MB45。
n. 磁力攪拌器。--例如IKA KMO 2基本攪拌器
o. 磁力攪拌棒。--例如，F(xiàn)isherbrand™PTFE攪拌棒12 x 6 mm有脊，20 x 6 mm帶脊，30 x 6 mm帶有脊，15 x 5 mm無(wú)脊。
p. 消化瓶250 mL Fisherbrand®蘇打玻璃廣口瓶，帶聚乙烯內(nèi)襯蓋（目錄號(hào)FB73219）
q. 實(shí)驗(yàn)室計(jì)時(shí)器。
r. 微型移液器例如Gilson Pipetman®（100µL）。 Woodside Industrial Estate, Dunstable, United Kingdom。
s. 正排量移液器例如，品牌HandyStep®S-含25 mL品牌PD Tip®（用于分配2.5或5 mL等分溶液1（PAA/AMG制劑）、4 mL等分IMS或50%IMS）和10 mL 50 mM乙酸使用5.0 mL Brand PD Tip®（分配0.1 mL溶液2和1.0 mL樣品溶液）。
t. 聚丙烯管Sarstedt聚丙烯管；40毫升、84 x 30毫米（目錄號(hào)62.555）和Sarstedt聚丙烯管；13mL，101 x 16.5毫米（目錄號(hào)60.541.685）。
u. 玻璃試管--16 x 100毫米，容量14毫升
v. 塑料“午餐盒”--大到足以容納試管架并用作冰水浴。
w. 可選：帶精密切割孔的聚丙烯板。--將40mL聚丙烯管固定并對(duì)齊在2mag Mixdrive 15®潛水磁力攪拌器的攪拌板上（圖2）。
D.試樣制備：
收集和準(zhǔn)備要吃的樣品，即應(yīng)準(zhǔn)備和烘烤烘焙混合物，煮意大利面等。如果脂肪含量>10%，則根據(jù)AOAC 985.29進(jìn)行脫脂。對(duì)于高水分樣品（>25%），最好冷凍干燥。在研磨機(jī)[B（a）]中研磨約50克，使其通過(guò)0.5毫米的篩子。將所有材料轉(zhuǎn)移到廣口塑料罐中，密封，通過(guò)搖晃和倒置充分混合。在有干燥劑的情況下儲(chǔ)存。在絞肉機(jī)中研磨濕樣品（如濕意大利面），得到均勻的糊狀物。取出代表性樣品進(jìn)行分析并記錄重量。另外，確定濕樣品的含水量，并在計(jì)算中考慮液體體積。
E. 樣品的酶消化
方法1. 分析約0.5克樣品的程序。
（a） 精確稱取約0.5 g樣品，精確到小數(shù)點(diǎn)后三位，放入30 x 84 mm（40 mL）聚丙烯管[C（t）]中。記錄重量。向每個(gè)試管中加入20 x 6 mm攪拌棒[C（o）]。
（b） 添加緩沖液。--用0.5 mL 95%v/v乙醇（或IMS）濕潤(rùn)樣品，并向每個(gè)試管中加入17.5 mL緩沖液[B（a）]（馬來(lái)酸鈉緩沖液50 mM，pH 6.0加2 mM CaCl2）。蓋上試管蓋，將其放在水浴中的2mg Mixdrive 15®潛水磁力攪拌器[C（d）]上，讓內(nèi)容物在170rpm的攪拌下平衡至37°C 5分鐘（見(jiàn)圖3）。
（c） 用PAA/AMG溶液孵育--加入2.5 mL溶液1（PAA/AMG溶液[A（1）]），蓋上試管蓋，在2mag Mixdrive 15®潛水磁力攪拌器上以37°C和170 rpm的速度孵育反應(yīng)溶液。
注意：如果使用[A（1）]中制備的該酶的（NH4）2SO4懸浮液，請(qǐng)加入1 mL酶懸浮液和1.5 mL緩沖液[B（A）]（馬來(lái)酸鈉緩沖液50 mM，pH 6.0加2 mM CaCl2）。
方法2. 分析約1.0 g樣品的程序（使用AOAC方法2017.16）。
（a） 精確稱取約1.0 g樣品，精確到小數(shù)點(diǎn)后三位，放入250 mL Fisherbrand玻璃®瓶中[C（p）]。記錄重量。向每個(gè)瓶子中加入一個(gè)30 x 6 mm的攪拌棒[C（o）]。
（b） 添加緩沖液。--用1.0 mL 95%v/v乙醇（或IMS）濕潤(rùn)樣品，并向每個(gè)瓶中加入35 mL緩沖液[B（a）]（馬來(lái)酸鈉緩沖液50 mM，pH 6.0加2 mM CaCl2）。蓋上瓶蓋，將瓶子放在水浴[C（C）]中的2mg Mixdrive 15®潛水磁力攪拌器[C（d）]上，讓內(nèi)容物在170rpm的攪拌下平衡至37°C 5分鐘（見(jiàn)圖3）。
（c） 用PAA/AMG溶液孵育--加入5 mL溶液1（PAA/AMG溶液[A（1）]），蓋上瓶蓋，在2mag Mixdrive 15®潛水磁力攪拌器上以37°C和170 rpm的速度孵育反應(yīng)溶液。
注意：如果使用[A（1）]中制備的該酶的(NH4)2SO4懸浮液，請(qǐng)加入2 mL酶懸浮液和3 mL緩沖液[B（A）]（馬來(lái)酸鈉緩沖液50 mM，pH 6.0加2 mM CaCl2）。
（b） 將每種溶液2mL轉(zhuǎn)移到2.0mL聚丙烯微量離心管[C（j）]中，以13000rpm離心5分鐘。
（c） 將兩份等分試樣（0.1 mL）轉(zhuǎn)移到16 x 100 mm玻璃試管[c（u）]的底部，加入0.1 mL溶液2（稀釋AMG（110 u/mL），[A（2b）]），混合均勻，在50°c下孵育30分鐘。然后加入3.0 mL GOPOD試劑[A（4）]，在50℃下孵育20分鐘。測(cè)量樣品和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（如下制備）在510 nm下相對(duì)于試劑空白的吸光度。
通過(guò)將0.2 mL緩沖液[B（e）]（乙酸鈉緩沖液，100 mM，pH 4.5）與3.0 mL GOPOD試劑混合來(lái)制備試劑空白溶液，并通過(guò)將0.1 mL瓶5（D-葡萄糖，1 mg/mL）[A（5）]加上0.1 mL緩沖液[P（e）][乙酸鈉緩沖液（100 mM，pH4.5）與3.0mL GOPOD試劑[A（4）]混合來(lái)制得D-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（一式四份）。將這些溶液與樣品溶液在50°C下孵育20分鐘。
（d） 按照第H節(jié)所述或使用適當(dāng)?shù)腗egaCalc™Excel®計(jì)算器計(jì)算RDS、SDS和TDS含量。
G. 抗性淀粉的測(cè)定：
（a） 240分鐘（4小時(shí)）后，在攪拌培養(yǎng)溶液（樣品加PAA/AMG）的同時(shí)，用正排量分配器[C（s）]取出4.0 mL懸浮液，并將其轉(zhuǎn)移到含有4.0 mL 95%v/v乙醇或IMS的101 x 16.5 mm聚丙烯管[C（t）]中。蓋上試管蓋，反復(fù)倒置試管，將內(nèi)容物徹底混合。
（b） 在臺(tái)式離心機(jī)[C（g）]中以4000 rpm的速度離心試管10分鐘，并在離心機(jī)停止后立即小心傾析上清液。通過(guò)在渦流混合器上攪拌，將顆粒重新懸浮在2 mL 50%v/v乙醇水溶液[B（g）]中。然后向試管中再加入6mL 50%v/v乙醇水溶液。蓋上試管蓋，在渦流混合器上混合內(nèi)容物。離心試管并回收顆粒。通過(guò)將管子倒置在吸水紙上，確保去除所有游離液體。再次，將顆粒重新懸浮在50%v/v乙醇水溶液（2+6 mL）中，以4000 rpm離心10分鐘。傾析上清液，去除游離液體，用Parafilm®覆蓋試管，直至進(jìn)行RS測(cè)定。
（c） 向每個(gè)試管中加入磁力攪拌棒（5 x 15 mm）[c（o）]和2 mL冷1.7 M NaOH[B（c）]。通過(guò)在磁力攪拌器上的冰/水浴中攪拌管內(nèi)容物約20分鐘，重新懸浮顆粒（并溶解RS）（圖4）。
（d） 在磁力攪拌器上攪拌的同時(shí)，向每個(gè)試管中加入8 mL緩沖液[B（d）]（1.0 M醋酸鈉緩沖液，pH 3.8）。立即加入0.1 mL瓶2（AMG 3300 U/mL）[A（2a）]，充分混合內(nèi)容物，將試管放入50°C的水浴中，在渦流混合器上間歇混合培養(yǎng)30分鐘。
（f） 對(duì)于RS含量>10%的樣品，將試管中的內(nèi)容物定量轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中（使用水洗瓶）。使用外部磁鐵將攪拌棒固定在管中，同時(shí)用水洗瓶清洗管中的溶液。用蒸餾水將體積調(diào)節(jié)至100毫升，并充分混合。在微量離心機(jī)中以13000 rpm的速度將溶液等分（2 mL）離心5分鐘。
（g） 對(duì)于RS含量<10%的樣品；以13000rpm離心等分（2mL）溶液5分鐘（無(wú)稀釋）。對(duì)于此類樣品，試管中的最終體積約為10.3 mL（但是，如果分析濕樣品，該體積會(huì)有所不同，計(jì)算中應(yīng)適當(dāng)考慮體積）。
（h） 將離心稀釋的[G（e）]或未稀釋的[G（f）]上清液的0.1 mL等分試樣（一式兩份）轉(zhuǎn)移到玻璃試管（16 x 100 mm）中，加入0.1 mL緩沖液[B（e））（100 mm醋酸鈉緩沖液，pH 4.5）和3.0 mL GOPOD試劑。在50°C下孵育20分鐘。在510 nm處測(cè)量樣品和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（如下制備）相對(duì)于試劑空白的吸光度。
通過(guò)將0.2 mL緩沖液[B（e）]（乙酸鈉緩沖液，100 mM，pH 4.5）與3.0 mL GOPOD試劑混合來(lái)制備試劑空白溶液，并通過(guò)將0.1 mL瓶5（D-葡萄糖，1 mg/mL）[A（5）]加上0.1 mL緩沖液[P（e）][乙酸鈉緩沖液（100 mM，pH4.5）與3.0mL GOPOD試劑[A（4）]混合來(lái)制得D-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（一式四份）。將這些溶液與樣品溶液在50°C下孵育20分鐘。
（i） 按照[H（b）]節(jié)所述或使用適當(dāng)?shù)腗egaCalc™Excel®計(jì)算器計(jì)算RS含量。
H.計(jì)算（可消化淀粉和抗性淀粉）
注意：使用Mega Calc™可以簡(jiǎn)化這些計(jì)算，該產(chǎn)品可從Megazyme網(wǎng)（www.Megazyme.com）上的產(chǎn)品下載。
（a） 計(jì)算測(cè)試樣品中的可消化淀粉（RDS、SDS和TDS）（%w/w，“原樣”基礎(chǔ)），如下所示：
方法1和2。
可消化淀粉（RDS、SDS或TDS）（g/100 g樣品）：
=ΔA x F x EV/W x D/0.1 x 100 x 1/1000000 x 162/180
=ΔA x F x EV/W x 0.0189
其中：
ΔA =根據(jù)反應(yīng)空白讀取RDS（ΔARDS）吸光度反應(yīng)20分鐘。根據(jù)反應(yīng)空白讀取SDS（ΔASDS）吸光度反應(yīng)120分鐘后減去ΔARDS。TDS（ΔATDS）吸光度反應(yīng)讀數(shù)240分鐘后反應(yīng)空白。
F =從吸光度到µg的轉(zhuǎn)換（測(cè)定GOPOD反應(yīng)中100µg D-葡萄糖的吸光度）[F=100（µg D-葡糖）除以100µg D-葡萄糖的GOPOD吸光度]。
EV =提取體積（mL）（方法1=20.5；方法2=41）。
W =分析樣品的“原樣”重量，單位為克；即約0.50克（方法1）或約1.0克（方法2）（精確稱重）。
D =樣品稀釋度（21；將1.0 mL樣品加入20 mL稀釋的乙酸中酸）。
0.1 =分析的樣品體積。
100 =換算為g/100g。
1000000 =從µg到g的轉(zhuǎn)換。
162/180 =從測(cè)定的游離D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為無(wú)水D-葡萄糖的因子正如淀粉中所發(fā)生的那樣。
（b） 按如下方式計(jì)算測(cè)試樣品中的抗性淀粉（RS）（%w/w，按“原樣”計(jì)算）：
抗性淀粉（g/100g樣品）：
=ΔA x F x EV/4 x FV/0.1 x 1/1000000 x 100/W x 162/180
=ΔA x F x EV/W x FV x 0.000225
其中：
ΔA =相對(duì)于試劑空白讀取的吸光度（反應(yīng)）。
F =從吸光度到µg的轉(zhuǎn)換（確定GOPOD反應(yīng)中100µg D-葡萄糖的吸光度[F=100（µg D-葡糖）除以這100µg D-葡糖的GOPOD吸光度]。
EV =提取體積（mL）（方法1=20.5；方法2=41）。
4 =從反應(yīng)混合物中提取的用于RS分析的溶液體積。
FV/0.1 =0.1 mL等分試樣，取自最終體積（FV；100 mL或10.3 mL），用于使用GOPOD試劑測(cè)定葡萄糖。
1000000 =從µg到g的轉(zhuǎn)換。
100/W =換算為g/100g。
W =分析樣品的“原樣”重量，單位為克；即0.50克或~1.0克（精確稱重）。
162/180 =從游離D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為淀粉中無(wú)水D-葡萄糖的因子。
附錄：
圖2.孵化方法1。樣品（約0.5 g）裝在40 mL、30 x 84 mm聚丙烯管中，置于水浴中2mg Mixdrive 15®潛水磁力攪拌器中。這種布置允許在受控速度（170 rpm）和37°C下攪拌15個(gè)樣品。
圖3.孵化方法2。樣品（約1.0 g）裝在Fisherbrand瓶中，置于水浴中2mg Mixdrive 15®潛水磁力攪拌器上。這種布置允許在受控速度（170 rpm）和37°C下攪拌15個(gè)樣品。
圖4.在磁力攪拌器上布置冰水浴，用于將抗性淀粉溶解在1.7 M NaOH中。
圖5.在淀粉葡萄糖苷酶（0.25或0.5 KU/測(cè)定）存在下，用胰α-淀粉酶（2.0 KU）水解1 g小麥淀粉（WS）或Fibersym™（FS；磷酸鹽交聯(lián)淀粉；RS4）。在不同時(shí)間間隔取出樣品，稀釋，終止反應(yīng)，測(cè)量D-葡萄糖并計(jì)算可消化淀粉。
表1.使用DSTRS測(cè)定程序在四天內(nèi)對(duì)樣品進(jìn)行兩次快速消化淀粉測(cè)量的重復(fù)性（%RSDr）。
a所有結(jié)果均按“原樣”以淀粉形式呈現(xiàn)
b每天對(duì)每種材料的樣品進(jìn)行兩次分析。
c SD=標(biāo)準(zhǔn)偏差；RSDr%=重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差。
表2.使用DSTRS測(cè)定程序在四天內(nèi)對(duì)七個(gè)研磨樣品進(jìn)行兩次緩慢消化淀粉測(cè)量的重復(fù)性（%RSDr）分析。
a所有結(jié)果均按“原樣”以淀粉形式呈現(xiàn)。
b每天對(duì)每種材料的樣品進(jìn)行兩次分析。
c SD=標(biāo)準(zhǔn)偏差；RSDr%=重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差。
測(cè)試樣品的緩慢消化淀粉含量在1.0至49.2%（w/w）的工作范圍內(nèi)。該樣品數(shù)據(jù)集的重復(fù)性（%RSDr）非常好，對(duì)于含有>1%SDS的樣品，重復(fù)性小于或等于11.63%（注：All Bran®的非常高的值是由于該組分的絕對(duì)淀粉值非常低）。
表3.使用DSTRS測(cè)定程序在四個(gè)單獨(dú)的日子里對(duì)七個(gè)研磨樣品進(jìn)行兩次總可消化淀粉測(cè)量的重復(fù)性（%RSDr）。
a所有結(jié)果均按“原樣”以淀粉形式呈現(xiàn)
b每天對(duì)每種材料的樣品進(jìn)行兩次分析。
c SD=標(biāo)準(zhǔn)偏差
RSDr %=重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差。
表4.使用DSTRS測(cè)定程序在四天內(nèi)對(duì)七個(gè)研磨樣品進(jìn)行兩次抗性淀粉測(cè)量的重復(fù)性（%RSDr）分析。
a所有結(jié)果均按“原樣”以淀粉形式呈現(xiàn)。
b每天對(duì)每種材料的樣品進(jìn)行兩次分析。
c SD=標(biāo)準(zhǔn)偏差；RSDr%=重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差。
測(cè)試樣品的抗性淀粉含量在0.3至51.8%（w/w）的工作范圍內(nèi)。該樣本數(shù)據(jù)集的重復(fù)性（%RSDr）非常好，所有樣本的重復(fù)性均小于或等于6.33%。
2. Wahlquist, M. I., Wilmshurst, E. G., Murton, C. R. & Richardson, E. N. (1978).鏈長(zhǎng)對(duì)葡萄糖吸收和相關(guān)代謝組反應(yīng)的影響。 Am. J. Clin. Nutr., 31, 1998-2001.
3. Jenkins, D. J. A., Mayer, A., Jenkins, A. L., Wolever, T. M. S., Collier, G. R., Wesson, V. & Cuff, D. (1978).簡(jiǎn)單和復(fù)雜碳水化合物：葡萄糖和葡萄糖聚合物之間缺乏血糖差異。 J. Clin. Nutr. Gastroenterol., 2, 113-116.
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簡(jiǎn)介：
專業(yè)用語(yǔ)，快速消化淀粉（RDS）、緩慢消化淀粉（SDS）和 Englyst1等人于1992年引入了抗淀粉酶淀粉（RS），以反映 體內(nèi)淀粉消化率。他們的工作，以及Wahlquist2等人的工作，Jenkins等人3 其他研究表明，食物的生理形態(tài)和淀粉的性質(zhì)是 淀粉消化速率的主要決定因素。在這段時(shí)間里，它 研究還表明，“可消化”淀粉可以同時(shí)水解和吸收 作為單糖，但有些淀粉在人體內(nèi)難以消化 腸。Englyst等人。4 在他們的研究中首次觀察到抗淀粉酶淀粉（RS）開(kāi)發(fā)了一種非淀粉多糖（NSP）的測(cè)量方法。這些作者認(rèn)為NSP是膳食纖維（DF）的最佳測(cè)量方法，因此所有淀粉都是在NSP的測(cè)量中溶解（使用DMSO）并水解去除。最近，食品法典委員會(huì)5發(fā)布了膳食纖維的定義包括耐消化淀粉（RS）和是否納入不易消化淀粉的決定低聚糖（NDO）留給各個(gè)國(guó)家。在RINTDF程序中，與胰腺α-淀粉酶/淀粉葡萄糖苷酶（PAA/AMG）孵育的時(shí)間設(shè)定為4小時(shí)，并優(yōu)化PAA和AMG的濃度，以確保一組純淀粉和含淀粉食品樣本的RS值與回腸造口術(shù)數(shù)據(jù)相匹配。最終，這兩種酶的濃度都達(dá)到飽和，這與Englyst等人1在其可消化淀粉方法中描述的工作一致。主要區(qū)別在于，在RINTDF程序中，使用了高度純化的即用型酶。
文獻(xiàn)表明，食物在人體小腸中的平均停留時(shí)間為4±1小時(shí)。因此，這被選為RINTDF程序中PAA/AMG的孵育時(shí)間。在Englyst等人1的可消化碳水化合物程序中，在20分鐘時(shí)取出樣品以測(cè)定快速消化淀粉（RDS），在120分鐘時(shí)取出緩慢消化淀粉（SDS），剩余的淀粉被定義為抗性淀粉（RS）。由于食物在小腸中的停留時(shí)間約為4小時(shí)，因此RS應(yīng)定義為在這段時(shí)間內(nèi)孵化后剩余的淀粉。我們現(xiàn)在引入一個(gè)新術(shù)語(yǔ)“總可消化淀粉（TDS）”來(lái)表示在4小時(shí)培養(yǎng)過(guò)程中水解的淀粉。因此，在當(dāng)前的測(cè)定方案中，在4小時(shí)時(shí)從培養(yǎng)混合物中取出額外的樣品以測(cè)量TDS。
抗性淀粉是樣品與PAA/AMG孵育4小時(shí)后剩余的淀粉。在目前的方法中，描述了RDS、SDS、TDS和RS的測(cè)量程序。這種方法適用于所有樣品。
原理：
根據(jù)用于在37°C下連續(xù)攪拌測(cè)量膳食纖維的程序（K-RINTDF；AOAC方法2017.16/2022.01），將純淀粉或含淀粉樣品與胰腺α-淀粉酶和淀粉葡萄糖苷酶（PAA/AMG）的混合物在pH 6.0的馬來(lái)酸鹽緩沖液中溫育4小時(shí)。在20分鐘（測(cè)量RDS）、120分鐘（測(cè)量SDS；SDS=120分鐘的淀粉值-20分鐘的淀粉價(jià)值）和240分鐘（測(cè)量TDS和RS）時(shí)去除反應(yīng)溶液的等分試樣。對(duì)于RDS、SDS和TDS，在攪拌懸浮液的同時(shí)取出1.0 mL等分試樣，并將其轉(zhuǎn)移到20 mL 50 mM乙酸中（以終止反應(yīng)）。將這些溶液充分混合，將0.1 mL等分試樣與0.1 mL AMG（100 U/mL）一起孵育，以將剩余的微量麥芽糖水解為葡萄糖，用GOPOD試劑測(cè)量。為了測(cè)量抗性淀粉（RS），在240分鐘（4小時(shí)）后從攪拌溶液中取出4毫升等分試樣，加入等體積的IMS中并充分混合。將樣品離心，用乙醇水溶液洗滌顆粒以去除游離葡萄糖，然后懸浮在氫氧化鈉中以溶解RS。溶液被中和，淀粉用AMG水解為葡萄糖，用GOPOD試劑測(cè)量葡萄糖（見(jiàn)圖1）。
用0.5 ml乙醇濕潤(rùn)樣品（0.5 g），在含有2 mM CaCl的20 ml馬來(lái)酸鈉緩沖液（50 mM，pH 6.0）中于37°C下與2 KU PAA和0.85 KU AMG一起孵育，并以170 rpm攪拌。
以不同的時(shí)間間隔取出等分試樣（1.0 mL），加入20.0 mL 50 mM乙酸以終止反應(yīng)（稀釋21倍）。
20分鐘RDS時(shí)1.0毫升
120分鐘時(shí)1.0 mL-$DS（SDS=120分鐘時(shí)的值，20分鐘時(shí)的數(shù)值）
240分鐘TDS（和可用碳水化合物）為1.0 mL
240分鐘時(shí)4.0 mL+4.0 mL耐乙醇淀粉
取出等分試樣（0.1 mL，一式兩份）與AMG一起孵育，并使用GOPOD試劑分析葡萄糖。
圖1. 根據(jù)方法1測(cè)量淀粉和食品樣品中RDS、SDS、TDS和RS的程序。
該方法適用于含有>2%w/w可消化淀粉（DS）或抗性淀粉（RS）的樣品。使用這些樣品，通�？梢赃_(dá)到±5%的標(biāo)準(zhǔn)誤差。DS或RS含量<2%w/w的樣品誤差更大。
套件：
可提供適用于進(jìn)行160次測(cè)定的試劑盒（RDS、SDS、TDS和RS各40次或各種其他組合）。試劑盒包含完整的檢測(cè)方法以及：
瓶1：純化PAA（40KU/g）和AMG（17KU/g）的混合物；5.2克。
密封儲(chǔ)存，在-10°C下干燥。有效期見(jiàn)單獨(dú)標(biāo)簽。
注意：有關(guān)本產(chǎn)品的適當(dāng)處理，請(qǐng)參閱SDS。
瓶2：pH 4.5和40°C下的淀粉糖苷酶[8 mL，3300 U/mL在可溶性淀粉上（或200 U/mL在對(duì)硝基苯β-麥芽糖苷上）]。
在4°C下儲(chǔ)存。有效期見(jiàn)單獨(dú)標(biāo)簽。
瓶3: GOPOD試劑緩沖液（50 mL，pH 7.4）。對(duì)羥基苯甲酸和疊氮化鈉（0.09%w/v）。
在4°C下儲(chǔ)存。有效期見(jiàn)單獨(dú)標(biāo)簽。
瓶4: GOPOD試劑酶。葡萄糖氧化酶加過(guò)氧化物酶和4-氨基安替比林。凍干粉。
儲(chǔ)存溫度低于-10°C。有效期見(jiàn)單獨(dú)標(biāo)簽。
瓶5: 在0.2%（w/v）苯甲酸中的D-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（5 mL，1.0 mg/mL）。
在室溫下密封儲(chǔ)存。有效期見(jiàn)單獨(dú)標(biāo)簽。
瓶6：可消化/抗性淀粉對(duì)照（約10克）。標(biāo)簽上顯示的可消化淀粉和抗性淀粉含量。
A.試劑溶液的制備
1.PAA/AMG儲(chǔ)備溶液。--PAA（4KU/5mL）加AMG（1.7KU/5 mL）。在使用前，將0.5 g PAA/AMG粉末混合物（瓶1）加入25 mL緩沖液[B（a）]（馬來(lái)酸鈉緩沖液50 mM，pH 6.0加2 mM CaCl2，制備方法見(jiàn)第4頁(yè)）中，在磁力攪拌器上攪拌5分鐘。使用時(shí)在冰上儲(chǔ)存。制備后4小時(shí)內(nèi)使用。這是解決方案1（PAA/AMG庫(kù)存解決方案）。
注意：硫酸銨懸浮液的制備方法如下：在通風(fēng)櫥的磁力攪拌器上，在100毫升燒杯中，將2.5克瓶子1（PAA 40 KU/g加AMG 17 KU/g）逐漸加入35毫升冷蒸餾水中，攪拌至酶完全溶解（約5分鐘）。加入17克顆粒狀硫酸銨，攪拌溶解。用硫酸銨溶液[B（f）]將體積調(diào)節(jié)至50毫升（制備方法見(jiàn)第5頁(yè)）。在4°C下穩(wěn)定≥3個(gè)月。
2a. AMG.使用隨附的瓶子2（淀粉葡萄糖苷酶）中的內(nèi)容物。
2b. 稀釋AMG。將1 mL瓶2的內(nèi)容物加入30 mL緩沖液[B（e）]（100 mM醋酸鈉緩沖液pH 4.5，制備方法見(jiàn)第5頁(yè)）�；旌暇鶆�，在13毫米聚丙烯管[C（t）]中分成約10毫升的等分試樣，在使用之間儲(chǔ)存在-10°C以下。這是溶液2（稀釋AMG（~110 U/mL））。
3. 用蒸餾水將GOPOD試劑緩沖瓶中的內(nèi)容物稀釋至1升。這是解決方案3。立即使用。
- 將GOPOD試劑酶瓶的內(nèi)容物溶解在20mL溶液3中，并將其定量轉(zhuǎn)移到裝有溶液3剩余部分的瓶中。用鋁箔蓋住這個(gè)瓶子，以保護(hù)封閉的試劑不受光線照射。這是葡萄糖測(cè)定試劑（GOPOD試劑）。在4°C下穩(wěn)定≥1個(gè)月，或在-10°C以下穩(wěn)定≥12個(gè)月。如果該試劑要冷凍儲(chǔ)存，應(yīng)將其分成約250毫升的等分試樣，并儲(chǔ)存在聚丙烯容器中。不要將這些儲(chǔ)存的溶液應(yīng)用于多個(gè)凍融循環(huán)。
5.使用提供的瓶子5中的內(nèi)容物。
6.使用隨附的瓶子6中的內(nèi)容物。
B.試劑（未提供）：
a. 馬來(lái)酸鈉緩沖液50 mM，pH 6.0加2 mM CaCl2。--將11.6 g馬來(lái)酸溶解在1600 mL去離子水中，用4 M（160 g/L）NaOH溶液將pH調(diào)節(jié)至6.0。加入0.6 g二水合氯化鈣（CaCl2·2H2O），溶解并調(diào)節(jié)體積至2 L。在4°C下儲(chǔ)存在密封良好的Duran®瓶中。這是緩沖區(qū)[B（a）]。
b. 乙酸溶液，50 mM。--向1 L容量瓶中加入2.9 mL冰醋酸（SigmaW200611-1KG-K；1.05 g/mL）。用去離子水稀釋至1 L，并儲(chǔ)存在4°C的Duran瓶中。
c. 氫氧化鈉溶液，1.7 M。——將68 g氫氧化鈉加入通風(fēng)櫥中的800 mL蒸餾水中，攪拌溶解。用蒸餾水將體積調(diào)節(jié)至1 L，并儲(chǔ)存在4°c的Duran®瓶中。
d. 醋酸鈉緩沖液，1.0 M，pH 3.8加氯化鈣（5 mM）將57.0 mL冰醋酸（1.05 g/mL）加入800 mL蒸餾水中，用4 M氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至3.8。加入0.74克二水合氯化鈣并溶解。用蒸餾水將體積調(diào)節(jié)至1 L，并儲(chǔ)存在4°C的Duran®瓶中。這是緩沖區(qū)[B（d）]。
e. 100 mM pH 4.5的醋酸鈉緩沖液。將5.7 mL冰醋酸（1.05 g/mL）加入800 mL蒸餾水中，用1 M氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至4.5。用蒸餾水將體積調(diào)節(jié)至1 L，并儲(chǔ)存在4°C的Duran®瓶中。這是緩沖區(qū)[B（e）]。
f. 50%w/v.硫酸銨溶液——將50克硫酸銨加入80毫升蒸餾水中，攪拌溶解。用蒸餾水將體積調(diào)節(jié)至100毫升。儲(chǔ)存在4°C的杜蘭瓶中。
g. 50%v/v乙醇水溶液和50%v/v IMS水溶液——向500 mL蒸餾水中加入500 mL乙醇（95%v/v）或工業(yè)甲基化酒精（IMS，95%v/v）。室溫下儲(chǔ)存在1L杜蘭瓶中。
C. 所需設(shè)備：
a. 研磨機(jī)。--離心式，帶12齒轉(zhuǎn)子和0.5毫米篩網(wǎng)，或類似裝置�；蛘撸L(fēng)研磨機(jī)可用于小型測(cè)試實(shí)驗(yàn)室樣品，前提是研磨機(jī)有足夠的空氣流量或其他冷卻方式，以避免樣品過(guò)熱。
b. 絞肉機(jī) --手動(dòng)或電動(dòng)，配備4.5毫米屏幕。
c. 水浴。--容納2毫克Mixdrive 15®潛水磁力攪拌器，帶浸沒(méi)式加熱器（如Lauda Alpha®）。（圖2所示的設(shè)置是最佳的）。
d. 潛水磁力攪拌器。--2mag Mixdrive 15®潛水磁力攪拌器。
e. 分光光度計(jì)--其能夠在510nm下操作、優(yōu)選地裝配有流通電池（10mm路徑長(zhǎng)度）。
f. 分析天平。--0.1mg可讀性、準(zhǔn)確性和精密度。
g. 臺(tái)式離心機(jī)--能夠容納101 x 16.5 mm的聚丙烯管，額定轉(zhuǎn)速約為3250 rcf（~4000 rpm），例如Sigma實(shí)驗(yàn)室離心機(jī)4-15，編號(hào)10730。
h. 冷凍干燥機(jī)--Virtis Genesis®25XL或類似產(chǎn)品。英國(guó)溫徹斯特生物制藥廠生物制藥工藝系統(tǒng)。
I. 微型離心機(jī)--轉(zhuǎn)速可達(dá)13000轉(zhuǎn)/分。
j. 一次性2.0 mL聚丙烯微量離心管例如Cat: Sarstedt。地址：72.691 Sarstedt有限公司，Drinagh，Ireland。
k. pH計(jì)。--例如 Seven Easy pH Mettler Toledo.。
l. 渦流混合器。--例如Daihan Scientific VM10。
m. 水分分析儀。--例如OHAUS MB45。
n. 磁力攪拌器。--例如IKA KMO 2基本攪拌器
o. 磁力攪拌棒。--例如，F(xiàn)isherbrand™PTFE攪拌棒12 x 6 mm有脊，20 x 6 mm帶脊，30 x 6 mm帶有脊，15 x 5 mm無(wú)脊。
p. 消化瓶250 mL Fisherbrand®蘇打玻璃廣口瓶，帶聚乙烯內(nèi)襯蓋（目錄號(hào)FB73219）
q. 實(shí)驗(yàn)室計(jì)時(shí)器。
r. 微型移液器例如Gilson Pipetman®（100µL）。 Woodside Industrial Estate, Dunstable, United Kingdom。
s. 正排量移液器例如，品牌HandyStep®S-含25 mL品牌PD Tip®（用于分配2.5或5 mL等分溶液1（PAA/AMG制劑）、4 mL等分IMS或50%IMS）和10 mL 50 mM乙酸使用5.0 mL Brand PD Tip®（分配0.1 mL溶液2和1.0 mL樣品溶液）。
t. 聚丙烯管Sarstedt聚丙烯管；40毫升、84 x 30毫米（目錄號(hào)62.555）和Sarstedt聚丙烯管；13mL，101 x 16.5毫米（目錄號(hào)60.541.685）。
u. 玻璃試管--16 x 100毫米，容量14毫升
v. 塑料“午餐盒”--大到足以容納試管架并用作冰水浴。
w. 可選：帶精密切割孔的聚丙烯板。--將40mL聚丙烯管固定并對(duì)齊在2mag Mixdrive 15®潛水磁力攪拌器的攪拌板上（圖2）。
D.試樣制備：
收集和準(zhǔn)備要吃的樣品，即應(yīng)準(zhǔn)備和烘烤烘焙混合物，煮意大利面等。如果脂肪含量>10%，則根據(jù)AOAC 985.29進(jìn)行脫脂。對(duì)于高水分樣品（>25%），最好冷凍干燥。在研磨機(jī)[B（a）]中研磨約50克，使其通過(guò)0.5毫米的篩子。將所有材料轉(zhuǎn)移到廣口塑料罐中，密封，通過(guò)搖晃和倒置充分混合。在有干燥劑的情況下儲(chǔ)存。在絞肉機(jī)中研磨濕樣品（如濕意大利面），得到均勻的糊狀物。取出代表性樣品進(jìn)行分析并記錄重量。另外，確定濕樣品的含水量，并在計(jì)算中考慮液體體積。
E. 樣品的酶消化
方法1. 分析約0.5克樣品的程序。
（a） 精確稱取約0.5 g樣品，精確到小數(shù)點(diǎn)后三位，放入30 x 84 mm（40 mL）聚丙烯管[C（t）]中。記錄重量。向每個(gè)試管中加入20 x 6 mm攪拌棒[C（o）]。
（b） 添加緩沖液。--用0.5 mL 95%v/v乙醇（或IMS）濕潤(rùn)樣品，并向每個(gè)試管中加入17.5 mL緩沖液[B（a）]（馬來(lái)酸鈉緩沖液50 mM，pH 6.0加2 mM CaCl2）。蓋上試管蓋，將其放在水浴中的2mg Mixdrive 15®潛水磁力攪拌器[C（d）]上，讓內(nèi)容物在170rpm的攪拌下平衡至37°C 5分鐘（見(jiàn)圖3）。
（c） 用PAA/AMG溶液孵育--加入2.5 mL溶液1（PAA/AMG溶液[A（1）]），蓋上試管蓋，在2mag Mixdrive 15®潛水磁力攪拌器上以37°C和170 rpm的速度孵育反應(yīng)溶液。
注意：如果使用[A（1）]中制備的該酶的（NH4）2SO4懸浮液，請(qǐng)加入1 mL酶懸浮液和1.5 mL緩沖液[B（A）]（馬來(lái)酸鈉緩沖液50 mM，pH 6.0加2 mM CaCl2）。
方法2. 分析約1.0 g樣品的程序（使用AOAC方法2017.16）。
（a） 精確稱取約1.0 g樣品，精確到小數(shù)點(diǎn)后三位，放入250 mL Fisherbrand玻璃®瓶中[C（p）]。記錄重量。向每個(gè)瓶子中加入一個(gè)30 x 6 mm的攪拌棒[C（o）]。
（b） 添加緩沖液。--用1.0 mL 95%v/v乙醇（或IMS）濕潤(rùn)樣品，并向每個(gè)瓶中加入35 mL緩沖液[B（a）]（馬來(lái)酸鈉緩沖液50 mM，pH 6.0加2 mM CaCl2）。蓋上瓶蓋，將瓶子放在水浴[C（C）]中的2mg Mixdrive 15®潛水磁力攪拌器[C（d）]上，讓內(nèi)容物在170rpm的攪拌下平衡至37°C 5分鐘（見(jiàn)圖3）。
（c） 用PAA/AMG溶液孵育--加入5 mL溶液1（PAA/AMG溶液[A（1）]），蓋上瓶蓋，在2mag Mixdrive 15®潛水磁力攪拌器上以37°C和170 rpm的速度孵育反應(yīng)溶液。
注意：如果使用[A（1）]中制備的該酶的(NH4)2SO4懸浮液，請(qǐng)加入2 mL酶懸浮液和3 mL緩沖液[B（A）]（馬來(lái)酸鈉緩沖液50 mM，pH 6.0加2 mM CaCl2）。
- 可消化淀粉的測(cè)定：
（b） 將每種溶液2mL轉(zhuǎn)移到2.0mL聚丙烯微量離心管[C（j）]中，以13000rpm離心5分鐘。
（c） 將兩份等分試樣（0.1 mL）轉(zhuǎn)移到16 x 100 mm玻璃試管[c（u）]的底部，加入0.1 mL溶液2（稀釋AMG（110 u/mL），[A（2b）]），混合均勻，在50°c下孵育30分鐘。然后加入3.0 mL GOPOD試劑[A（4）]，在50℃下孵育20分鐘。測(cè)量樣品和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（如下制備）在510 nm下相對(duì)于試劑空白的吸光度。
通過(guò)將0.2 mL緩沖液[B（e）]（乙酸鈉緩沖液，100 mM，pH 4.5）與3.0 mL GOPOD試劑混合來(lái)制備試劑空白溶液，并通過(guò)將0.1 mL瓶5（D-葡萄糖，1 mg/mL）[A（5）]加上0.1 mL緩沖液[P（e）][乙酸鈉緩沖液（100 mM，pH4.5）與3.0mL GOPOD試劑[A（4）]混合來(lái)制得D-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（一式四份）。將這些溶液與樣品溶液在50°C下孵育20分鐘。
（d） 按照第H節(jié)所述或使用適當(dāng)?shù)腗egaCalc™Excel®計(jì)算器計(jì)算RDS、SDS和TDS含量。
G. 抗性淀粉的測(cè)定：
（a） 240分鐘（4小時(shí)）后，在攪拌培養(yǎng)溶液（樣品加PAA/AMG）的同時(shí)，用正排量分配器[C（s）]取出4.0 mL懸浮液，并將其轉(zhuǎn)移到含有4.0 mL 95%v/v乙醇或IMS的101 x 16.5 mm聚丙烯管[C（t）]中。蓋上試管蓋，反復(fù)倒置試管，將內(nèi)容物徹底混合。
（b） 在臺(tái)式離心機(jī)[C（g）]中以4000 rpm的速度離心試管10分鐘，并在離心機(jī)停止后立即小心傾析上清液。通過(guò)在渦流混合器上攪拌，將顆粒重新懸浮在2 mL 50%v/v乙醇水溶液[B（g）]中。然后向試管中再加入6mL 50%v/v乙醇水溶液。蓋上試管蓋，在渦流混合器上混合內(nèi)容物。離心試管并回收顆粒。通過(guò)將管子倒置在吸水紙上，確保去除所有游離液體。再次，將顆粒重新懸浮在50%v/v乙醇水溶液（2+6 mL）中，以4000 rpm離心10分鐘。傾析上清液，去除游離液體，用Parafilm®覆蓋試管，直至進(jìn)行RS測(cè)定。
（c） 向每個(gè)試管中加入磁力攪拌棒（5 x 15 mm）[c（o）]和2 mL冷1.7 M NaOH[B（c）]。通過(guò)在磁力攪拌器上的冰/水浴中攪拌管內(nèi)容物約20分鐘，重新懸浮顆粒（并溶解RS）（圖4）。
（d） 在磁力攪拌器上攪拌的同時(shí)，向每個(gè)試管中加入8 mL緩沖液[B（d）]（1.0 M醋酸鈉緩沖液，pH 3.8）。立即加入0.1 mL瓶2（AMG 3300 U/mL）[A（2a）]，充分混合內(nèi)容物，將試管放入50°C的水浴中，在渦流混合器上間歇混合培養(yǎng)30分鐘。
（f） 對(duì)于RS含量>10%的樣品，將試管中的內(nèi)容物定量轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中（使用水洗瓶）。使用外部磁鐵將攪拌棒固定在管中，同時(shí)用水洗瓶清洗管中的溶液。用蒸餾水將體積調(diào)節(jié)至100毫升，并充分混合。在微量離心機(jī)中以13000 rpm的速度將溶液等分（2 mL）離心5分鐘。
（g） 對(duì)于RS含量<10%的樣品；以13000rpm離心等分（2mL）溶液5分鐘（無(wú)稀釋）。對(duì)于此類樣品，試管中的最終體積約為10.3 mL（但是，如果分析濕樣品，該體積會(huì)有所不同，計(jì)算中應(yīng)適當(dāng)考慮體積）。
（h） 將離心稀釋的[G（e）]或未稀釋的[G（f）]上清液的0.1 mL等分試樣（一式兩份）轉(zhuǎn)移到玻璃試管（16 x 100 mm）中，加入0.1 mL緩沖液[B（e））（100 mm醋酸鈉緩沖液，pH 4.5）和3.0 mL GOPOD試劑。在50°C下孵育20分鐘。在510 nm處測(cè)量樣品和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（如下制備）相對(duì)于試劑空白的吸光度。
通過(guò)將0.2 mL緩沖液[B（e）]（乙酸鈉緩沖液，100 mM，pH 4.5）與3.0 mL GOPOD試劑混合來(lái)制備試劑空白溶液，并通過(guò)將0.1 mL瓶5（D-葡萄糖，1 mg/mL）[A（5）]加上0.1 mL緩沖液[P（e）][乙酸鈉緩沖液（100 mM，pH4.5）與3.0mL GOPOD試劑[A（4）]混合來(lái)制得D-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（一式四份）。將這些溶液與樣品溶液在50°C下孵育20分鐘。
（i） 按照[H（b）]節(jié)所述或使用適當(dāng)?shù)腗egaCalc™Excel®計(jì)算器計(jì)算RS含量。
H.計(jì)算（可消化淀粉和抗性淀粉）
注意：使用Mega Calc™可以簡(jiǎn)化這些計(jì)算，該產(chǎn)品可從Megazyme網(wǎng)（www.Megazyme.com）上的產(chǎn)品下載。
（a） 計(jì)算測(cè)試樣品中的可消化淀粉（RDS、SDS和TDS）（%w/w，“原樣”基礎(chǔ)），如下所示：
方法1和2。
可消化淀粉（RDS、SDS或TDS）（g/100 g樣品）：
=ΔA x F x EV/W x D/0.1 x 100 x 1/1000000 x 162/180
=ΔA x F x EV/W x 0.0189
其中：
ΔA =根據(jù)反應(yīng)空白讀取RDS（ΔARDS）吸光度反應(yīng)20分鐘。根據(jù)反應(yīng)空白讀取SDS（ΔASDS）吸光度反應(yīng)120分鐘后減去ΔARDS。TDS（ΔATDS）吸光度反應(yīng)讀數(shù)240分鐘后反應(yīng)空白。
F =從吸光度到µg的轉(zhuǎn)換（測(cè)定GOPOD反應(yīng)中100µg D-葡萄糖的吸光度）[F=100（µg D-葡糖）除以100µg D-葡萄糖的GOPOD吸光度]。
EV =提取體積（mL）（方法1=20.5；方法2=41）。
W =分析樣品的“原樣”重量，單位為克；即約0.50克（方法1）或約1.0克（方法2）（精確稱重）。
D =樣品稀釋度（21；將1.0 mL樣品加入20 mL稀釋的乙酸中酸）。
0.1 =分析的樣品體積。
100 =換算為g/100g。
1000000 =從µg到g的轉(zhuǎn)換。
162/180 =從測(cè)定的游離D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為無(wú)水D-葡萄糖的因子正如淀粉中所發(fā)生的那樣。
（b） 按如下方式計(jì)算測(cè)試樣品中的抗性淀粉（RS）（%w/w，按“原樣”計(jì)算）：
抗性淀粉（g/100g樣品）：
=ΔA x F x EV/4 x FV/0.1 x 1/1000000 x 100/W x 162/180
=ΔA x F x EV/W x FV x 0.000225
其中：
ΔA =相對(duì)于試劑空白讀取的吸光度（反應(yīng)）。
F =從吸光度到µg的轉(zhuǎn)換（確定GOPOD反應(yīng)中100µg D-葡萄糖的吸光度[F=100（µg D-葡糖）除以這100µg D-葡糖的GOPOD吸光度]。
EV =提取體積（mL）（方法1=20.5；方法2=41）。
4 =從反應(yīng)混合物中提取的用于RS分析的溶液體積。
FV/0.1 =0.1 mL等分試樣，取自最終體積（FV；100 mL或10.3 mL），用于使用GOPOD試劑測(cè)定葡萄糖。
1000000 =從µg到g的轉(zhuǎn)換。
100/W =換算為g/100g。
W =分析樣品的“原樣”重量，單位為克；即0.50克或~1.0克（精確稱重）。
162/180 =從游離D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為淀粉中無(wú)水D-葡萄糖的因子。
附錄：
表1.使用DSTRS測(cè)定程序在四天內(nèi)對(duì)樣品進(jìn)行兩次快速消化淀粉測(cè)量的重復(fù)性（%RSDr）。
b每天對(duì)每種材料的樣品進(jìn)行兩次分析。
c SD=標(biāo)準(zhǔn)偏差；RSDr%=重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差。
表2.使用DSTRS測(cè)定程序在四天內(nèi)對(duì)七個(gè)研磨樣品進(jìn)行兩次緩慢消化淀粉測(cè)量的重復(fù)性（%RSDr）分析。
b每天對(duì)每種材料的樣品進(jìn)行兩次分析。
c SD=標(biāo)準(zhǔn)偏差；RSDr%=重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差。
測(cè)試樣品的緩慢消化淀粉含量在1.0至49.2%（w/w）的工作范圍內(nèi)。該樣品數(shù)據(jù)集的重復(fù)性（%RSDr）非常好，對(duì)于含有>1%SDS的樣品，重復(fù)性小于或等于11.63%（注：All Bran®的非常高的值是由于該組分的絕對(duì)淀粉值非常低）。
表3.使用DSTRS測(cè)定程序在四個(gè)單獨(dú)的日子里對(duì)七個(gè)研磨樣品進(jìn)行兩次總可消化淀粉測(cè)量的重復(fù)性（%RSDr）。
b每天對(duì)每種材料的樣品進(jìn)行兩次分析。
c SD=標(biāo)準(zhǔn)偏差
RSDr %=重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差。
表4.使用DSTRS測(cè)定程序在四天內(nèi)對(duì)七個(gè)研磨樣品進(jìn)行兩次抗性淀粉測(cè)量的重復(fù)性（%RSDr）分析。
a所有結(jié)果均按“原樣”以淀粉形式呈現(xiàn)。b每天對(duì)每種材料的樣品進(jìn)行兩次分析。
c SD=標(biāo)準(zhǔn)偏差；RSDr%=重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差。
測(cè)試樣品的抗性淀粉含量在0.3至51.8%（w/w）的工作范圍內(nèi)。該樣本數(shù)據(jù)集的重復(fù)性（%RSDr）非常好，所有樣本的重復(fù)性均小于或等于6.33%。
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標(biāo)簽：
可消化和抗性淀粉檢測(cè)K-DSTRS
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