抗性淀粉檢試劑盒K-RSTAR使用說明書
抗性淀粉檢測程序（100 次/盒）K-RSTAR
AOAC 方法 2002.02
AACC 方法 32-40.01
CODEX 第二類方法
產(chǎn)品介紹：
根據(jù)定義，抗性淀粉（RS）是指不會被人類小腸中的酶水解的淀粉。抗性淀粉會進入大腸，在大腸中微生物的作用下，部分或全部發(fā)酵�？剐缘矸弁ǔ１灰暈榭偵攀忱w維（TDF）的組分之一。
1982年，Englyst等人在測定非淀粉多糖時，首次發(fā)現(xiàn)了抗酶水解淀粉組分1。Berry2在這項研究的基礎(chǔ)上加以擴展，開發(fā)了一種抗性淀粉測定程序。該程序結(jié)合了Englyst等人1采用的α-淀粉酶/普魯蘭酶處理方法，但省略了將樣品加熱至100 ℃的初始步驟，使檢測條件更接近生理條件。經(jīng)改進后，測得的樣品抗性淀粉含量大幅提高。隨后，Englyst等人3-5以健康的回腸造口患者為試驗對象證實了這一發(fā)現(xiàn)。
到20世紀90年代初，研究人員已充分認識到抗性淀粉的生理功能。歐洲抗性淀粉協(xié)會（EURESTA）的研究計劃開發(fā)了多種新的/改良方法6,7。Champ7方法基于Berry2方法進行改進，可直接測定抗性淀粉。主要改進包括將樣品量從10 mg增至100 mg，只使用胰腺α-淀粉酶（而不是與Englyst1和Berry2一樣使用胰腺α-淀粉酶加普魯蘭酶）來消化樣品，以及在pH 6.9下進行孵育（Englyst1和Berry2在pH 5.2下進行孵育）。這種方法直接用顆粒物測定抗性淀粉含量。Muir和O’Dea8開發(fā)的檢測程序則將樣品嚼碎，先用胃蛋白酶處理，添加胰α-淀粉酶和淀粉葡糖苷酶混合物，然后置于振蕩水浴槽中，在pH 5.0，37 °C下孵育15個小時。通過離心回收殘余顆粒物（含抗性淀粉），用乙酸鹽緩沖液離心洗滌，并通過加熱、加入二甲基亞砜（DMSO）和耐熱α-淀粉酶共同作用，消化抗性淀粉。
Fausant等人9、Goni等人10、Akerberg等人11和Champ等人12對這些方法進行了改進，包括進行以下變更：使用的酶濃度、使用的酶類型（所有方法都使用胰α-淀粉酶，不再使用普魯蘭酶，一些方法改用淀粉葡糖苷酶）、樣品預處理方式（嚼碎）、孵育步驟的pH值以及在α-淀粉酶孵育步驟后添加（或不添加）乙醇。所有改進都會對抗性淀粉的測定結(jié)果產(chǎn)生一定影響。
在開發(fā)當前改進的RS檢測方法時，我們的目標是提供一種穩(wěn)健而可靠的方法，以（盡可能地）模擬體內(nèi)條件，并得出具有生理意義的數(shù)據(jù)（請參閱表1，第12頁）。為此，我們13研究了胰α-淀粉酶濃度、孵育步驟pH值對測定結(jié)果的影響，麥芽糖對α-淀粉酶抑制作用的重要性，是否有必要添加淀粉葡糖苷酶，振蕩和攪拌對測定結(jié)果的影響，以及在回收和分析顆粒狀抗性淀粉的過程中面臨的問題。如本手冊所述，我們開發(fā)的方法能夠測定樣品中的抗性淀粉、可溶性淀粉和總淀粉含量。本方法可在24小時內(nèi)分析24個樣品。本檢測程序已在美國分析化學家協(xié)會（AOAC International）和美國谷物化學家協(xié)會（AACC）14的組織下接受實驗室間評估（參閱表2，第13頁），并獲得了兩個機構(gòu)的認可（AOAC官方方法2002.02；AACC方法32-40.01）。
原理：
將樣品置于振蕩水浴槽中，用胰α-淀粉酶和淀粉葡糖苷酶（AMG）在37 ℃下孵育16個小時。在此期間，在兩種酶的共同作用下，非抗性淀粉被溶解并水解成D-葡萄糖。加入等體積的酒精或工業(yè)甲基化酒精（IMS，亦稱變性酒精）來終止反應，通過離心回收顆粒狀的抗性淀粉。用酒精或IMS（50% v/v）水溶液重懸并洗滌兩次，回收顆粒，然后再離心，傾析去除游離液體。使用磁力攪拌器，在冰水浴槽中劇烈攪拌，將顆粒物中的抗性淀粉溶于2 M KOH中。用乙酸鹽緩沖液中和溶液，然后用AMG將抗性淀粉定量水解成葡萄糖。用葡萄糖氧化酶/過氧化物酶試劑（GOPOD）測定D-葡萄糖，測得結(jié)果可表示樣品的抗性淀粉含量。將原始上清液和洗滌液混合均勻，定容至100 mL，用GOPOD法測定D-葡萄糖含量，以此來測定非抗性淀粉（可溶性淀粉）含量。
適用性和準確性：
本方法適用于抗性淀粉含量（w/w）高于2%的樣品。對于適用樣品，標準誤差通常在±5%以內(nèi)。對于抗性淀粉含量（w/w）低于2%的樣品，誤差較大。
試劑盒：
可進行100次抗性淀粉測定的試劑盒。試劑盒包含完整的檢測方法以及：
1 號瓶： 淀粉葡糖苷酶【12 mL，在 pH 5.0 和 40 °C 的條件下，以可溶性淀粉為底物時的酶活力為 3300 U/mL（或者，以對硝基苯基-β-麥芽糖苷*為底物時的酶活力為 200U/mL）】。淀粉葡糖苷酶溶液中應基本不含可檢出的游離 D-葡萄糖。
在4 ℃下存放。有效期見單獨的標簽。
* 完 整 的酶活 檢測程序可訪問 www.megazyme.com 查 看 —— 產(chǎn)品代碼：
R-AMGR3。
2 號瓶： 胰 α-淀粉酶（胰酶制劑，10 g，酶活為 3 Ceralpha Units/mg）。-10 ℃以下存放。有效期見單獨的標簽。
3 號瓶： GOPOD 試劑緩沖液。緩沖液（50 mL，pH 7.4），對羥基苯甲酸和疊氮化鈉（0.09% w/v）。
在4 ℃下存放。有效期見單獨的標簽。
4 號瓶： GOPOD 試劑酶。葡萄糖氧化酶和過氧化物酶，以及 4-氨基安替比林。凍干粉。
-10 ℃以下存放。有效期見單獨的標簽。
5 號瓶： D-葡萄糖標準溶液（5 mL，1.0 mg/mL），溶于 0.2%（w/v）苯甲酸中。
室溫存放。有效期見單獨的標簽。
6 號瓶： 抗性淀粉對照樣品。抗性淀粉含量標注在標簽上。
室溫存放。有效期見單獨的標簽。
試劑溶液/懸液制備：
1. 直接使用 1 號瓶（3300 U/mL AMG 溶液）的內(nèi)容物。該溶液粘稠，應使用正位移移液器（例如 Eppendorf Multipette®，帶 5.0 mL Combitip®分液管）移�。ǚ峙� 0.1 mL 等分溶液）。
同樣需要準備的：
溶液1（稀釋的AMG，300 U/mL）：用0.1 M馬來酸鈉緩沖液（0.1 M，pH 6.0；試劑1；未提供）將2 mL的1號瓶酶液（3300 U/mL AMG溶液）稀釋至22 mL。將稀釋后的溶液以5 mL/管進行分裝，不使用時用聚丙烯容器冷凍儲存。
可反復凍融，在-10 °C以下可穩(wěn)定儲存2年以上。
2. 現(xiàn)配現(xiàn)用，將 1 g 2 號瓶內(nèi)容物（胰 α-淀粉酶）添加至 100 mL 馬來酸鈉緩沖液（100 mM，pH 6.0；試劑 1；未提供）中，攪拌 5 分鐘，制成懸液。加入 1.0 mL溶液 1（稀釋好的 AMG，300 U/mL）并混合均勻。以>1500 g 的離心力下離心10 分鐘，并小心倒出上清液。這就是溶液 2（10 mg/mL 胰 α-淀粉酶，包含 3 U/mL AMG），應在制備當天使用。
3. 用蒸餾水將 GOPOD 試劑緩沖液稀釋至 1 L（即溶液 3）。現(xiàn)配現(xiàn)用。
注意：
1. 在儲存期間，濃縮緩沖液可能形成鹽晶體。在使用蒸餾水將緩沖液稀釋至1 L時，必須將其完全溶解。
2. 緩沖液中含0.09%（w/v）的疊氮化鈉。這是一種有毒的化學物質(zhì)，應按照要求小心處理。
4. 用 20 mL 溶液 3 溶解 GOPOD 試劑酶，并將得到的溶液定量轉(zhuǎn)移至裝有剩余溶液 3 的容器中。用鋁箔包裹容器，以避免瓶內(nèi)試劑受到光的照射。該試劑即為葡萄糖測定試劑（GOPOD 試劑）。
在 4 ℃下可穩(wěn)定儲存 1 個月以上，在-10 °C 以下可穩(wěn)定儲存 12 個月以上。
如果該試劑以冷凍狀態(tài)儲存，最好將其分裝，在使用過程中僅冷凍/解凍一次。新配制的試劑可能呈淡黃色或淡粉色。在4 ℃儲存期間，溶液顏色會逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樯罘奂t色。以蒸餾水為背景時，該溶液的吸光度應小于0.05。
5 & 6. 直接使用5號瓶和6號瓶內(nèi)容物。
試劑（未提供）：
試劑應使用分析純或同等級別。
1. 馬來酸鈉緩沖液（100 mM，pH 6.0）加 2 mM 二水氯化鈣。
將23.2 g馬來酸（Sigma，貨號M0375）溶解于1600 mL蒸餾水中，并用4 M（160 g/L）氫氧化鈉將pH值調(diào)節(jié)至6.0。加入0.6 g二水氯化鈣（CaCl2.2H2O）并溶解。定容至2 L。
在4 ℃下儲存。
2. 乙酸鈉緩沖液（1.2 M，pH 3.8）。
將68.6 mL冰乙酸（1.05 g/mL）添加至800 mL蒸餾水中，并用4 M氫氧化鈉將pH值調(diào)節(jié)至3.8。用蒸餾水定容至1 L。
在4 ℃下儲存。
3. 乙酸鈉緩沖液（100 mM，pH 4.5）。
將5.8 mL冰乙酸添加至900 mL蒸餾水中，并用4 M氫氧化鈉將pH值調(diào)節(jié)至4.5。用蒸餾水定容至1 L。
在4 ℃下儲存。
4. 氫氧化鉀溶液（2 M）。
將112.2 g氫氧化鉀（KOH）添加至900 mL去離子水中，攪拌溶解。定容至1 L。儲存于密封容器中。
室溫儲存。
5. 約 50% v/v 乙醇（或 IMS）溶液。
將500 mL乙醇（95% v/v或99% v/v）或工業(yè)甲基化酒精（IMS；變性酒精；約95% v/v的乙醇加上5% v/v的甲醇）添加至500 mL水中。室溫下儲存于密封良好的容器中。
6. 99% v/v 乙醇
99%v/v的乙醇�；蛘撸�95% v/v的乙醇或工業(yè)甲基化酒精（IMS；變性酒精；約95% v/v的乙醇加上5% v/v的甲醇）也可以使用。
注意：
愛爾蘭 Megazyme 提供一組抗性淀粉含量從 0.6%至 78% w/w 的質(zhì)控樣品（貨號 K-RSTCL）。
設(shè)備（推薦）：
1. 磨碎機——離心磨碎機，配有 12 齒轉(zhuǎn)子，篩網(wǎng)孔徑為 1.0 mm，或類似設(shè)備。另外，小劑量試樣也可使用旋風式磨碎機。
2. 絞肉機——手動或電動，配有 4.5 mm 篩網(wǎng)。
3. 臺式離心機——可容納 16×120 mm 玻璃試管，離心力約為 1,500 g（約 3,000 rpm）。
4. 振蕩水浴裝置（Grant OLS 200）（Grant 儀器劍橋有限公司）（或類似裝置），在轉(zhuǎn)盤上以每分鐘100轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)速做線性運動（相當于每分鐘200沖程的振蕩速度），沖程長度為 35 mm，溫度設(shè)定為 37 °C。
5. 水浴裝置——可將溫度維持在 50+/-0.1 °C。
6. 漩渦混合器。
7. 磁力攪拌器。
8. 磁力攪拌子——5×15 mm。
9. pH 計。
10. （數(shù)字）秒表/計時器。
11. 分析天平（精確到 0.1 mg）。
12. 分光光度計——可在 510 nm 波長下工作，最好配有流通池（光徑長度為 10 mm）。
13. 移液器——可移取 100 μL 液體；配有一次性分液管。另外，也可使用手持式分液器。
14. 正位移移液器——配備 50 mL 分液管，可移取 2.0 mL、3.0 mL 和 4.0 mL 液體。
15. 康寧®培養(yǎng)管——螺旋蓋，16×125 mm[Fisher 科技，型號 TKV-173-030B（試管）；TKV-178-020V（管蓋）]，F(xiàn)isher 科技，interact@fisher.co.uk。
16. 玻璃試管——16×100 mm，14 mL 容量。
17. 塑料材質(zhì)的“午餐盒”，容量足以容納試管架，并且可以作為冰水浴槽（見第10 頁圖 1）。
18. 溫度計——可精確讀取 37+/-0.1 °C 和 50+/-0.1 °C。
19. 容量瓶——100 mL、200 mL、500 mL、1 L 和 2 L 容量。
樣品制備：
將約50 g谷物或凍干植株或食品放入磨碎機中磨碎，直至通過孔徑為1.0 mm的篩網(wǎng)。將所有樣品材料轉(zhuǎn)移至一個寬口塑料罐中，通過振蕩和顛倒搖晃混合均勻。工業(yè)用淀粉通常以細粉形態(tài)提供，不需要研磨。用手動或電動絞肉機絞碎新鮮樣品（例如，豆粒罐頭、香蕉、馬鈴薯），直至通過孔徑約為4.5 mm的篩網(wǎng)。依照AOAC方法925.10（15）測定干樣品的含水量，新鮮樣品則依AOAC方法925.10，用烘箱干燥后進行凍干處理。
檢測程序：
（a） 非抗性淀粉水解和增溶。
i. 準確稱取 100±5 mg 樣品，置于螺旋蓋試管中（康寧®培養(yǎng)管；16×125 mm），輕輕敲擊試管壁，確保樣品落至管底。
注意：對于絞碎的豆粒罐頭或食品等濕樣品，樣品質(zhì)量為0.5 g左右（準確稱量）。
這些樣品的含水量通常為60%至80%。
ii. 向每個試管中加入 4.0 mL 溶液 2（胰 α-淀粉酶（10 mg/mL），含 3 U/mLAMG）混合溶液。
iii. 旋緊管蓋，將試管置于旋渦混合器上混合均勻，然后將試管沿振蕩器運動方向水平排列，放置在振蕩水浴槽中（見第 11 頁圖 2 和圖 3）。
iv. 將試管內(nèi)容物在 37 ℃下，連續(xù)振蕩（200 沖程/分鐘）孵育 16 小時整（注意：對于振蕩器的線性運動，100 轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)速相當于 200 沖程/分鐘；前進 100 沖程，后退 100 沖程）。
v. 將試管從水浴槽中取出，用紙巾擦干外壁殘留水珠。旋下管蓋，加入 4.0 mL乙醇（99% v/v）或 IMS（99% v/v），邊加入邊在漩渦混合器上劇烈攪拌。
vi. 將試管在 1500 g（約 3000 rpm）下離心 10 分鐘（不蓋管蓋）。
vii. 小心倒出上清液，再加入 2 mL 50% v/v 的乙醇（或 50% v/v 的 IMS），懸浮顆粒，邊加入邊在旋渦混合器上劇烈攪拌。再加入 6 mL 50% v/v 的乙醇，混合均勻，然后在 1500 g 下再次離心 10 分鐘。
viii.倒出上清液，再重復一次上述重懸和離心步驟。
ix. 小心倒出上清液，并將試管倒置于吸水紙上，以吸干多余的液體。
（b） 測定抗性淀粉。
i. 向每個試管中加入 2 mL 2 M 氫氧化鉀，并將磁力攪拌子（5×15mm）放入試管。將試管置于冰水中，在磁力攪拌器上攪拌約 20 分鐘，使顆粒重懸（并溶解抗性淀粉）（圖 1，第 10 頁）。
注意：
1. 不要使用漩渦混合器攪拌，否則可能導致淀粉乳化。
2. 確保在加入氫氧化鉀溶液的同時劇烈攪拌試管內(nèi)容物。這可以避免生成難以溶解的淀粉團塊。
ii. 向每個試管中加入 8 mL 1.2 M 乙酸鈉緩沖液（pH 3.8），邊加邊用磁力攪拌器攪拌。立即添加 0.1 mL 溶液 1（AMG，3300 U/mL），混合均勻，然后將試管置于 50 ℃的水浴槽中。
iii. 孵育 30 分鐘，間歇性的將試管置于旋渦混合器上攪拌。
iv. 對于抗性淀粉含量>10%的樣品；（使用一個水洗瓶）將試管內(nèi)容物定量轉(zhuǎn)移至一個 100 mL 的容量瓶中。利用一個外部磁鐵將磁力攪拌子懸浮在試管內(nèi)，并用水洗瓶沖洗試管中的溶液。用蒸餾水定容至 100 mL 并混合均勻。將該溶液的等分溶液在 1500 g 下離心 10 分鐘。
v. 對于抗性淀粉含量<10%的樣品；直接將試管在 1500 g 下離心 10 分鐘（不稀釋）。對于這類樣品，試管內(nèi)的最終體積約為 10.3 mL（然而，具體體積因樣品而異，濕樣品的體積差異尤為顯著，在計算時應考慮到溶液體積的差異）。
vi. 將稀釋（步驟 iv）或未稀釋（步驟 v）上清液的 0.1 mL 等分溶液（一式兩份）轉(zhuǎn)移至玻璃試管中（16×100 mm），加入 3.0 mL GOPOD 試劑，在 50 °C 下孵育20 分鐘。
vii. 對照試劑空白樣，測定每份溶液在 510 nm 波長下的吸光度值。
制備試劑空白樣：將0.1 mL 100 mM的乙酸鈉緩沖液（pH 4.5）與3.0 mL GOPOD試劑混合。
制備 D-葡萄糖標準溶液（一式四份）：將 0.1 mL 瓶 5（D-葡萄糖,1 mg/mL）與3.0 mL GOPOD 試劑混合。
（c） 測定非抗性（可溶性）淀粉。
i. 將初始孵育溶液離心得到的上清液[步驟（a）vii，第 8 頁]與隨后兩次用 50%乙醇洗滌得到的上清液[步驟（a）viii 和（a）ix，第 8 頁]合并至一個容量瓶中，用 100 mM 乙酸鈉緩沖液（pH 4.5）定容至 100 mL�；旌暇鶆颉�
ii. 取 0.1 mL 等分溶液（一式兩份），加入 10 μL 溶液 1（稀釋后的 AMG, 300 U/mL），在 50°C 下孵育 20 分鐘。加入 3.0 mL GOPOD 試劑，在 50°C 下再孵育20 分鐘。
iii. 以試劑空白為對照，測定溶液在 510 nm 波長下的吸光度值。
iv. 計算非抗性（可溶性）淀粉含量。
總淀粉含量為抗性淀粉與非抗性（可溶性）淀粉之和。
計算：
注：這些計算可通過使用Megazyme 的Mega-Calc™來簡化, 您可以從Megazyme網(wǎng)站上相關(guān)產(chǎn)品頁面進行下載（www.megayzme.com）。
按以下公式，計算試樣中的抗性淀粉、非抗性（可溶性）淀粉和總淀粉含量（%，干重）：
式中：
ΔA =以試劑空白為對照讀取的吸光度值（反應）值。
F =吸光度值到微克的轉(zhuǎn)換系數(shù)（100 μg D-葡萄糖在GOPOD反應中的吸光度值已經(jīng)確定，F(xiàn)=100（D-葡萄糖的質(zhì)量 μg）除以100 μg D-葡萄糖的GOPOD吸光度值。
100/0.1 =體積校正（從100 mL中量取0.1 mL）。
1/1000 =微克至毫克的換算系數(shù)。
W =分析樣品的干重
=“原樣”質(zhì)量×[（100-含水量）/100]。
100/W =抗性淀粉在樣品質(zhì)量中的百分比系數(shù)。
162/180 =將測定的游離D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為淀粉中的無水D-葡萄糖的系數(shù)。
10.3/0.1 =抗性淀粉含量為0至10%的樣品（孵育溶液不進行稀釋，且最終體積約
為10.3 mL）的容量校正（從10.3 mL中量取0.1mL）。濕樣品的終體積更大，在計算時應考慮到這一點。
表 1：多種體外分析方法測得的抗性淀粉值與體內(nèi)結(jié)果的比較
a 數(shù)值表示抗性淀粉占樣品總淀粉含量的百分比。除 McCleary、Goni 等人（10）的數(shù)據(jù)以及 ActiStarR 的數(shù)值外，所有數(shù)據(jù)均來自 Champ 等人（16）。
b 來自 Goni 等人（10）。
c 來自 Goni 等人（10），將抗性淀粉含量表示為占總淀粉含量的百分比，假定大豆片的淀粉含量為 40%，玉米片的淀粉含量為 70%（基于類似原料的內(nèi)部測定結(jié)果）。
d 除 McCleary 提供的數(shù)據(jù)（內(nèi)部數(shù)據(jù)）外，由 Bernd Kettlitz、Cerestar、Vilvoorde、Belgium 慷慨提供的結(jié)果。“Englyst”數(shù)據(jù)由 Englyst Carbohydrate Services 提供；“Champ”數(shù)據(jù)由法國國家農(nóng)業(yè)科學研究院（南特）提供，“Goni”數(shù)據(jù)由 Cerestar（維爾福德）提供。
表 2：酶解法測定淀粉樣品和選定植物原料中抗性淀粉含量的方法性能（AOAC/AACC 實驗室間研究結(jié)果）
a 在“原樣”基礎(chǔ)上計算（香蕉、蕓豆和玉米片“原樣”指的是凍干樣品）
b（c） b=合作實驗室數(shù)量（異常值實驗室數(shù)量）
d r=2.8×Sr
e R=2.8×SR
f 高直鏈玉米淀粉
參考文獻：
1. Englyst, H., Wiggins, H. L. & Cummins, J. H. (1982). Analyst, 107, 307-318.
2. Berry, C. S. (1986). J. Cereal Sci., 4, 301-314.
3. Englyst, H. N. & Cummins, J. H. (1985). Am. J. Clin. Nutr., 42, 778-787.
4. Englyst, H. N. & Cummins, J. H. (1986). Am. J. Clin. Nutr., 44, 42-50.
5. Englyst, H. N. & Cummins, J. H. (1987). Am. J. Clin. Nutr., 45, 423-431.
6. Englyst, H. N., Kingman, S. M. & Cummins, J. H. (1992). European J. Clin. Nutr., 46 (Suppl. 2), S33-S50.
7. Champ, M. (1992). Eur. J. Clin. Nutr., 46 (Suppl. 2), S51-S62.
8. Muir, J. G. & O’Dea, K. (1992). Am. J. Clin. Nutr., 56, 123-127.
9. Faisant, N., Planchot, V., Kozlowski, F., Pacouret, M. -P., Colonna, P. & Champ, M. (1995). Sciences des Aliments, 15, 83-89.
10. Goni, I., Garcia-Diz, E., Manas, E. & Saura-Calixto, F. (1996). Fd. Chem., 56, 445-449.
11. Akerberg, A. K. E., Liljberg, G. M., Granfeldt, Y. E., Drews, A. W. & Bjorck, M. E. (1998). Am. Soc. Nutr. Sciences, 128, 651-660.
12. Champ, M., Martin, L., Noah, L. & Gratas, M. (1999). “Complex Carbohydrates in Foods” (S. S. Cho, L. Prosky & M. Dreher, Eds.), pp. 169-187, Marcel Dekker, Inc., New York, USA.
13. McCleary, B. V. & Monaghan, D. A. (2002). J. AOAC International, 85, 665-675.
14. McCleary, B. V., McNally, M. & Rossiter, P. (2002). J. AOAC International, 85, 103-1111.
15. Official Methods of Analysis (2000). 17th Ed., AOAC INTERNATIONAL.
16. Champ, M., Kozlowski, F. & Lecannu, G. (2000). “Advanced Dietary Fibre Technology” (B. V. McCleary & L. Prosky, Eds.), pp 106-119, Blackwell Science Ltd., Oxford, UK.
AOAC 方法 2002.02
AACC 方法 32-40.01
CODEX 第二類方法
產(chǎn)品介紹：
根據(jù)定義，抗性淀粉（RS）是指不會被人類小腸中的酶水解的淀粉。抗性淀粉會進入大腸，在大腸中微生物的作用下，部分或全部發(fā)酵�？剐缘矸弁ǔ１灰暈榭偵攀忱w維（TDF）的組分之一。
1982年，Englyst等人在測定非淀粉多糖時，首次發(fā)現(xiàn)了抗酶水解淀粉組分1。Berry2在這項研究的基礎(chǔ)上加以擴展，開發(fā)了一種抗性淀粉測定程序。該程序結(jié)合了Englyst等人1采用的α-淀粉酶/普魯蘭酶處理方法，但省略了將樣品加熱至100 ℃的初始步驟，使檢測條件更接近生理條件。經(jīng)改進后，測得的樣品抗性淀粉含量大幅提高。隨后，Englyst等人3-5以健康的回腸造口患者為試驗對象證實了這一發(fā)現(xiàn)。
到20世紀90年代初，研究人員已充分認識到抗性淀粉的生理功能。歐洲抗性淀粉協(xié)會（EURESTA）的研究計劃開發(fā)了多種新的/改良方法6,7。Champ7方法基于Berry2方法進行改進，可直接測定抗性淀粉。主要改進包括將樣品量從10 mg增至100 mg，只使用胰腺α-淀粉酶（而不是與Englyst1和Berry2一樣使用胰腺α-淀粉酶加普魯蘭酶）來消化樣品，以及在pH 6.9下進行孵育（Englyst1和Berry2在pH 5.2下進行孵育）。這種方法直接用顆粒物測定抗性淀粉含量。Muir和O’Dea8開發(fā)的檢測程序則將樣品嚼碎，先用胃蛋白酶處理，添加胰α-淀粉酶和淀粉葡糖苷酶混合物，然后置于振蕩水浴槽中，在pH 5.0，37 °C下孵育15個小時。通過離心回收殘余顆粒物（含抗性淀粉），用乙酸鹽緩沖液離心洗滌，并通過加熱、加入二甲基亞砜（DMSO）和耐熱α-淀粉酶共同作用，消化抗性淀粉。
Fausant等人9、Goni等人10、Akerberg等人11和Champ等人12對這些方法進行了改進，包括進行以下變更：使用的酶濃度、使用的酶類型（所有方法都使用胰α-淀粉酶，不再使用普魯蘭酶，一些方法改用淀粉葡糖苷酶）、樣品預處理方式（嚼碎）、孵育步驟的pH值以及在α-淀粉酶孵育步驟后添加（或不添加）乙醇。所有改進都會對抗性淀粉的測定結(jié)果產(chǎn)生一定影響。
在開發(fā)當前改進的RS檢測方法時，我們的目標是提供一種穩(wěn)健而可靠的方法，以（盡可能地）模擬體內(nèi)條件，并得出具有生理意義的數(shù)據(jù)（請參閱表1，第12頁）。為此，我們13研究了胰α-淀粉酶濃度、孵育步驟pH值對測定結(jié)果的影響，麥芽糖對α-淀粉酶抑制作用的重要性，是否有必要添加淀粉葡糖苷酶，振蕩和攪拌對測定結(jié)果的影響，以及在回收和分析顆粒狀抗性淀粉的過程中面臨的問題。如本手冊所述，我們開發(fā)的方法能夠測定樣品中的抗性淀粉、可溶性淀粉和總淀粉含量。本方法可在24小時內(nèi)分析24個樣品。本檢測程序已在美國分析化學家協(xié)會（AOAC International）和美國谷物化學家協(xié)會（AACC）14的組織下接受實驗室間評估（參閱表2，第13頁），并獲得了兩個機構(gòu)的認可（AOAC官方方法2002.02；AACC方法32-40.01）。
原理：
將樣品置于振蕩水浴槽中，用胰α-淀粉酶和淀粉葡糖苷酶（AMG）在37 ℃下孵育16個小時。在此期間，在兩種酶的共同作用下，非抗性淀粉被溶解并水解成D-葡萄糖。加入等體積的酒精或工業(yè)甲基化酒精（IMS，亦稱變性酒精）來終止反應，通過離心回收顆粒狀的抗性淀粉。用酒精或IMS（50% v/v）水溶液重懸并洗滌兩次，回收顆粒，然后再離心，傾析去除游離液體。使用磁力攪拌器，在冰水浴槽中劇烈攪拌，將顆粒物中的抗性淀粉溶于2 M KOH中。用乙酸鹽緩沖液中和溶液，然后用AMG將抗性淀粉定量水解成葡萄糖。用葡萄糖氧化酶/過氧化物酶試劑（GOPOD）測定D-葡萄糖，測得結(jié)果可表示樣品的抗性淀粉含量。將原始上清液和洗滌液混合均勻，定容至100 mL，用GOPOD法測定D-葡萄糖含量，以此來測定非抗性淀粉（可溶性淀粉）含量。
適用性和準確性：
本方法適用于抗性淀粉含量（w/w）高于2%的樣品。對于適用樣品，標準誤差通常在±5%以內(nèi)。對于抗性淀粉含量（w/w）低于2%的樣品，誤差較大。
試劑盒：
可進行100次抗性淀粉測定的試劑盒。試劑盒包含完整的檢測方法以及：
1 號瓶： 淀粉葡糖苷酶【12 mL，在 pH 5.0 和 40 °C 的條件下，以可溶性淀粉為底物時的酶活力為 3300 U/mL（或者，以對硝基苯基-β-麥芽糖苷*為底物時的酶活力為 200U/mL）】。淀粉葡糖苷酶溶液中應基本不含可檢出的游離 D-葡萄糖。
在4 ℃下存放。有效期見單獨的標簽。
* 完 整 的酶活 檢測程序可訪問 www.megazyme.com 查 看 —— 產(chǎn)品代碼：
R-AMGR3。
2 號瓶： 胰 α-淀粉酶（胰酶制劑，10 g，酶活為 3 Ceralpha Units/mg）。-10 ℃以下存放。有效期見單獨的標簽。
3 號瓶： GOPOD 試劑緩沖液。緩沖液（50 mL，pH 7.4），對羥基苯甲酸和疊氮化鈉（0.09% w/v）。
在4 ℃下存放。有效期見單獨的標簽。
4 號瓶： GOPOD 試劑酶。葡萄糖氧化酶和過氧化物酶，以及 4-氨基安替比林。凍干粉。
-10 ℃以下存放。有效期見單獨的標簽。
5 號瓶： D-葡萄糖標準溶液（5 mL，1.0 mg/mL），溶于 0.2%（w/v）苯甲酸中。
室溫存放。有效期見單獨的標簽。
6 號瓶： 抗性淀粉對照樣品。抗性淀粉含量標注在標簽上。
室溫存放。有效期見單獨的標簽。
試劑溶液/懸液制備：
1. 直接使用 1 號瓶（3300 U/mL AMG 溶液）的內(nèi)容物。該溶液粘稠，應使用正位移移液器（例如 Eppendorf Multipette®，帶 5.0 mL Combitip®分液管）移�。ǚ峙� 0.1 mL 等分溶液）。
同樣需要準備的：
溶液1（稀釋的AMG，300 U/mL）：用0.1 M馬來酸鈉緩沖液（0.1 M，pH 6.0；試劑1；未提供）將2 mL的1號瓶酶液（3300 U/mL AMG溶液）稀釋至22 mL。將稀釋后的溶液以5 mL/管進行分裝，不使用時用聚丙烯容器冷凍儲存。
可反復凍融，在-10 °C以下可穩(wěn)定儲存2年以上。
2. 現(xiàn)配現(xiàn)用，將 1 g 2 號瓶內(nèi)容物（胰 α-淀粉酶）添加至 100 mL 馬來酸鈉緩沖液（100 mM，pH 6.0；試劑 1；未提供）中，攪拌 5 分鐘，制成懸液。加入 1.0 mL溶液 1（稀釋好的 AMG，300 U/mL）并混合均勻。以>1500 g 的離心力下離心10 分鐘，并小心倒出上清液。這就是溶液 2（10 mg/mL 胰 α-淀粉酶，包含 3 U/mL AMG），應在制備當天使用。
3. 用蒸餾水將 GOPOD 試劑緩沖液稀釋至 1 L（即溶液 3）。現(xiàn)配現(xiàn)用。
注意：
1. 在儲存期間，濃縮緩沖液可能形成鹽晶體。在使用蒸餾水將緩沖液稀釋至1 L時，必須將其完全溶解。
2. 緩沖液中含0.09%（w/v）的疊氮化鈉。這是一種有毒的化學物質(zhì)，應按照要求小心處理。
4. 用 20 mL 溶液 3 溶解 GOPOD 試劑酶，并將得到的溶液定量轉(zhuǎn)移至裝有剩余溶液 3 的容器中。用鋁箔包裹容器，以避免瓶內(nèi)試劑受到光的照射。該試劑即為葡萄糖測定試劑（GOPOD 試劑）。
在 4 ℃下可穩(wěn)定儲存 1 個月以上，在-10 °C 以下可穩(wěn)定儲存 12 個月以上。
如果該試劑以冷凍狀態(tài)儲存，最好將其分裝，在使用過程中僅冷凍/解凍一次。新配制的試劑可能呈淡黃色或淡粉色。在4 ℃儲存期間，溶液顏色會逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樯罘奂t色。以蒸餾水為背景時，該溶液的吸光度應小于0.05。
5 & 6. 直接使用5號瓶和6號瓶內(nèi)容物。
試劑（未提供）：
試劑應使用分析純或同等級別。
1. 馬來酸鈉緩沖液（100 mM，pH 6.0）加 2 mM 二水氯化鈣。
將23.2 g馬來酸（Sigma，貨號M0375）溶解于1600 mL蒸餾水中，并用4 M（160 g/L）氫氧化鈉將pH值調(diào)節(jié)至6.0。加入0.6 g二水氯化鈣（CaCl2.2H2O）并溶解。定容至2 L。
在4 ℃下儲存。
2. 乙酸鈉緩沖液（1.2 M，pH 3.8）。
將68.6 mL冰乙酸（1.05 g/mL）添加至800 mL蒸餾水中，并用4 M氫氧化鈉將pH值調(diào)節(jié)至3.8。用蒸餾水定容至1 L。
在4 ℃下儲存。
3. 乙酸鈉緩沖液（100 mM，pH 4.5）。
將5.8 mL冰乙酸添加至900 mL蒸餾水中，并用4 M氫氧化鈉將pH值調(diào)節(jié)至4.5。用蒸餾水定容至1 L。
在4 ℃下儲存。
4. 氫氧化鉀溶液（2 M）。
將112.2 g氫氧化鉀（KOH）添加至900 mL去離子水中，攪拌溶解。定容至1 L。儲存于密封容器中。
室溫儲存。
5. 約 50% v/v 乙醇（或 IMS）溶液。
將500 mL乙醇（95% v/v或99% v/v）或工業(yè)甲基化酒精（IMS；變性酒精；約95% v/v的乙醇加上5% v/v的甲醇）添加至500 mL水中。室溫下儲存于密封良好的容器中。
6. 99% v/v 乙醇
99%v/v的乙醇�；蛘撸�95% v/v的乙醇或工業(yè)甲基化酒精（IMS；變性酒精；約95% v/v的乙醇加上5% v/v的甲醇）也可以使用。
注意：
愛爾蘭 Megazyme 提供一組抗性淀粉含量從 0.6%至 78% w/w 的質(zhì)控樣品（貨號 K-RSTCL）。
設(shè)備（推薦）：
1. 磨碎機——離心磨碎機，配有 12 齒轉(zhuǎn)子，篩網(wǎng)孔徑為 1.0 mm，或類似設(shè)備。另外，小劑量試樣也可使用旋風式磨碎機。
2. 絞肉機——手動或電動，配有 4.5 mm 篩網(wǎng)。
3. 臺式離心機——可容納 16×120 mm 玻璃試管，離心力約為 1,500 g（約 3,000 rpm）。
4. 振蕩水浴裝置（Grant OLS 200）（Grant 儀器劍橋有限公司）（或類似裝置），在轉(zhuǎn)盤上以每分鐘100轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)速做線性運動（相當于每分鐘200沖程的振蕩速度），沖程長度為 35 mm，溫度設(shè)定為 37 °C。
5. 水浴裝置——可將溫度維持在 50+/-0.1 °C。
6. 漩渦混合器。
7. 磁力攪拌器。
8. 磁力攪拌子——5×15 mm。
9. pH 計。
10. （數(shù)字）秒表/計時器。
11. 分析天平（精確到 0.1 mg）。
12. 分光光度計——可在 510 nm 波長下工作，最好配有流通池（光徑長度為 10 mm）。
13. 移液器——可移取 100 μL 液體；配有一次性分液管。另外，也可使用手持式分液器。
14. 正位移移液器——配備 50 mL 分液管，可移取 2.0 mL、3.0 mL 和 4.0 mL 液體。
15. 康寧®培養(yǎng)管——螺旋蓋，16×125 mm[Fisher 科技，型號 TKV-173-030B（試管）；TKV-178-020V（管蓋）]，F(xiàn)isher 科技，interact@fisher.co.uk。
16. 玻璃試管——16×100 mm，14 mL 容量。
17. 塑料材質(zhì)的“午餐盒”，容量足以容納試管架，并且可以作為冰水浴槽（見第10 頁圖 1）。
18. 溫度計——可精確讀取 37+/-0.1 °C 和 50+/-0.1 °C。
19. 容量瓶——100 mL、200 mL、500 mL、1 L 和 2 L 容量。
樣品制備：
將約50 g谷物或凍干植株或食品放入磨碎機中磨碎，直至通過孔徑為1.0 mm的篩網(wǎng)。將所有樣品材料轉(zhuǎn)移至一個寬口塑料罐中，通過振蕩和顛倒搖晃混合均勻。工業(yè)用淀粉通常以細粉形態(tài)提供，不需要研磨。用手動或電動絞肉機絞碎新鮮樣品（例如，豆粒罐頭、香蕉、馬鈴薯），直至通過孔徑約為4.5 mm的篩網(wǎng)。依照AOAC方法925.10（15）測定干樣品的含水量，新鮮樣品則依AOAC方法925.10，用烘箱干燥后進行凍干處理。
檢測程序：
（a） 非抗性淀粉水解和增溶。
i. 準確稱取 100±5 mg 樣品，置于螺旋蓋試管中（康寧®培養(yǎng)管；16×125 mm），輕輕敲擊試管壁，確保樣品落至管底。
注意：對于絞碎的豆粒罐頭或食品等濕樣品，樣品質(zhì)量為0.5 g左右（準確稱量）。
這些樣品的含水量通常為60%至80%。
ii. 向每個試管中加入 4.0 mL 溶液 2（胰 α-淀粉酶（10 mg/mL），含 3 U/mLAMG）混合溶液。
iii. 旋緊管蓋，將試管置于旋渦混合器上混合均勻，然后將試管沿振蕩器運動方向水平排列，放置在振蕩水浴槽中（見第 11 頁圖 2 和圖 3）。
iv. 將試管內(nèi)容物在 37 ℃下，連續(xù)振蕩（200 沖程/分鐘）孵育 16 小時整（注意：對于振蕩器的線性運動，100 轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)速相當于 200 沖程/分鐘；前進 100 沖程，后退 100 沖程）。
v. 將試管從水浴槽中取出，用紙巾擦干外壁殘留水珠。旋下管蓋，加入 4.0 mL乙醇（99% v/v）或 IMS（99% v/v），邊加入邊在漩渦混合器上劇烈攪拌。
vi. 將試管在 1500 g（約 3000 rpm）下離心 10 分鐘（不蓋管蓋）。
vii. 小心倒出上清液，再加入 2 mL 50% v/v 的乙醇（或 50% v/v 的 IMS），懸浮顆粒，邊加入邊在旋渦混合器上劇烈攪拌。再加入 6 mL 50% v/v 的乙醇，混合均勻，然后在 1500 g 下再次離心 10 分鐘。
viii.倒出上清液，再重復一次上述重懸和離心步驟。
ix. 小心倒出上清液，并將試管倒置于吸水紙上，以吸干多余的液體。
（b） 測定抗性淀粉。
i. 向每個試管中加入 2 mL 2 M 氫氧化鉀，并將磁力攪拌子（5×15mm）放入試管。將試管置于冰水中，在磁力攪拌器上攪拌約 20 分鐘，使顆粒重懸（并溶解抗性淀粉）（圖 1，第 10 頁）。
注意：
1. 不要使用漩渦混合器攪拌，否則可能導致淀粉乳化。
2. 確保在加入氫氧化鉀溶液的同時劇烈攪拌試管內(nèi)容物。這可以避免生成難以溶解的淀粉團塊。
ii. 向每個試管中加入 8 mL 1.2 M 乙酸鈉緩沖液（pH 3.8），邊加邊用磁力攪拌器攪拌。立即添加 0.1 mL 溶液 1（AMG，3300 U/mL），混合均勻，然后將試管置于 50 ℃的水浴槽中。
iii. 孵育 30 分鐘，間歇性的將試管置于旋渦混合器上攪拌。
iv. 對于抗性淀粉含量>10%的樣品；（使用一個水洗瓶）將試管內(nèi)容物定量轉(zhuǎn)移至一個 100 mL 的容量瓶中。利用一個外部磁鐵將磁力攪拌子懸浮在試管內(nèi)，并用水洗瓶沖洗試管中的溶液。用蒸餾水定容至 100 mL 并混合均勻。將該溶液的等分溶液在 1500 g 下離心 10 分鐘。
v. 對于抗性淀粉含量<10%的樣品；直接將試管在 1500 g 下離心 10 分鐘（不稀釋）。對于這類樣品，試管內(nèi)的最終體積約為 10.3 mL（然而，具體體積因樣品而異，濕樣品的體積差異尤為顯著，在計算時應考慮到溶液體積的差異）。
vi. 將稀釋（步驟 iv）或未稀釋（步驟 v）上清液的 0.1 mL 等分溶液（一式兩份）轉(zhuǎn)移至玻璃試管中（16×100 mm），加入 3.0 mL GOPOD 試劑，在 50 °C 下孵育20 分鐘。
vii. 對照試劑空白樣，測定每份溶液在 510 nm 波長下的吸光度值。
制備試劑空白樣：將0.1 mL 100 mM的乙酸鈉緩沖液（pH 4.5）與3.0 mL GOPOD試劑混合。
制備 D-葡萄糖標準溶液（一式四份）：將 0.1 mL 瓶 5（D-葡萄糖,1 mg/mL）與3.0 mL GOPOD 試劑混合。
（c） 測定非抗性（可溶性）淀粉。
i. 將初始孵育溶液離心得到的上清液[步驟（a）vii，第 8 頁]與隨后兩次用 50%乙醇洗滌得到的上清液[步驟（a）viii 和（a）ix，第 8 頁]合并至一個容量瓶中，用 100 mM 乙酸鈉緩沖液（pH 4.5）定容至 100 mL�；旌暇鶆颉�
ii. 取 0.1 mL 等分溶液（一式兩份），加入 10 μL 溶液 1（稀釋后的 AMG, 300 U/mL），在 50°C 下孵育 20 分鐘。加入 3.0 mL GOPOD 試劑，在 50°C 下再孵育20 分鐘。
iii. 以試劑空白為對照，測定溶液在 510 nm 波長下的吸光度值。
iv. 計算非抗性（可溶性）淀粉含量。
總淀粉含量為抗性淀粉與非抗性（可溶性）淀粉之和。
計算：
注：這些計算可通過使用Megazyme 的Mega-Calc™來簡化, 您可以從Megazyme網(wǎng)站上相關(guān)產(chǎn)品頁面進行下載（www.megayzme.com）。
按以下公式，計算試樣中的抗性淀粉、非抗性（可溶性）淀粉和總淀粉含量（%，干重）：
ΔA =以試劑空白為對照讀取的吸光度值（反應）值。
F =吸光度值到微克的轉(zhuǎn)換系數(shù)（100 μg D-葡萄糖在GOPOD反應中的吸光度值已經(jīng)確定，F(xiàn)=100（D-葡萄糖的質(zhì)量 μg）除以100 μg D-葡萄糖的GOPOD吸光度值。
100/0.1 =體積校正（從100 mL中量取0.1 mL）。
1/1000 =微克至毫克的換算系數(shù)。
W =分析樣品的干重
=“原樣”質(zhì)量×[（100-含水量）/100]。
100/W =抗性淀粉在樣品質(zhì)量中的百分比系數(shù)。
162/180 =將測定的游離D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為淀粉中的無水D-葡萄糖的系數(shù)。
10.3/0.1 =抗性淀粉含量為0至10%的樣品（孵育溶液不進行稀釋，且最終體積約
為10.3 mL）的容量校正（從10.3 mL中量取0.1mL）。濕樣品的終體積更大，在計算時應考慮到這一點。
表 1：多種體外分析方法測得的抗性淀粉值與體內(nèi)結(jié)果的比較
a 數(shù)值表示抗性淀粉占樣品總淀粉含量的百分比。除 McCleary、Goni 等人（10）的數(shù)據(jù)以及 ActiStarR 的數(shù)值外，所有數(shù)據(jù)均來自 Champ 等人（16）。b 來自 Goni 等人（10）。
c 來自 Goni 等人（10），將抗性淀粉含量表示為占總淀粉含量的百分比，假定大豆片的淀粉含量為 40%，玉米片的淀粉含量為 70%（基于類似原料的內(nèi)部測定結(jié)果）。
d 除 McCleary 提供的數(shù)據(jù)（內(nèi)部數(shù)據(jù)）外，由 Bernd Kettlitz、Cerestar、Vilvoorde、Belgium 慷慨提供的結(jié)果。“Englyst”數(shù)據(jù)由 Englyst Carbohydrate Services 提供；“Champ”數(shù)據(jù)由法國國家農(nóng)業(yè)科學研究院（南特）提供，“Goni”數(shù)據(jù)由 Cerestar（維爾福德）提供。
表 2：酶解法測定淀粉樣品和選定植物原料中抗性淀粉含量的方法性能（AOAC/AACC 實驗室間研究結(jié)果）
a 在“原樣”基礎(chǔ)上計算（香蕉、蕓豆和玉米片“原樣”指的是凍干樣品）b（c） b=合作實驗室數(shù)量（異常值實驗室數(shù)量）
d r=2.8×Sr
e R=2.8×SR
f 高直鏈玉米淀粉
參考文獻：1. Englyst, H., Wiggins, H. L. & Cummins, J. H. (1982). Analyst, 107, 307-318.
2. Berry, C. S. (1986). J. Cereal Sci., 4, 301-314.
3. Englyst, H. N. & Cummins, J. H. (1985). Am. J. Clin. Nutr., 42, 778-787.
4. Englyst, H. N. & Cummins, J. H. (1986). Am. J. Clin. Nutr., 44, 42-50.
5. Englyst, H. N. & Cummins, J. H. (1987). Am. J. Clin. Nutr., 45, 423-431.
6. Englyst, H. N., Kingman, S. M. & Cummins, J. H. (1992). European J. Clin. Nutr., 46 (Suppl. 2), S33-S50.
7. Champ, M. (1992). Eur. J. Clin. Nutr., 46 (Suppl. 2), S51-S62.
8. Muir, J. G. & O’Dea, K. (1992). Am. J. Clin. Nutr., 56, 123-127.
9. Faisant, N., Planchot, V., Kozlowski, F., Pacouret, M. -P., Colonna, P. & Champ, M. (1995). Sciences des Aliments, 15, 83-89.
10. Goni, I., Garcia-Diz, E., Manas, E. & Saura-Calixto, F. (1996). Fd. Chem., 56, 445-449.
11. Akerberg, A. K. E., Liljberg, G. M., Granfeldt, Y. E., Drews, A. W. & Bjorck, M. E. (1998). Am. Soc. Nutr. Sciences, 128, 651-660.
12. Champ, M., Martin, L., Noah, L. & Gratas, M. (1999). “Complex Carbohydrates in Foods” (S. S. Cho, L. Prosky & M. Dreher, Eds.), pp. 169-187, Marcel Dekker, Inc., New York, USA.
13. McCleary, B. V. & Monaghan, D. A. (2002). J. AOAC International, 85, 665-675.
14. McCleary, B. V., McNally, M. & Rossiter, P. (2002). J. AOAC International, 85, 103-1111.
15. Official Methods of Analysis (2000). 17th Ed., AOAC INTERNATIONAL.
16. Champ, M., Kozlowski, F. & Lecannu, G. (2000). “Advanced Dietary Fibre Technology” (B. V. McCleary & L. Prosky, Eds.), pp 106-119, Blackwell Science Ltd., Oxford, UK.
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抗性淀粉檢K-RSTAR
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