期刊：Nature Communications
影響因子：15.7
通訊單位：中科院微生物研究所
通訊作者：孟頌東、李鑫、韋榮國
伯豪技術(shù)服務(wù)：單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序

導(dǎo)語
當(dāng)前，面對諸如SARS-CoV-2、流感等高變異率病毒的持續(xù)威脅，傳統(tǒng)疫苗設(shè)計(jì)面臨兩大核心瓶頸：一是所誘導(dǎo)的中和抗體反應(yīng)往往持續(xù)時(shí)間短且交叉保護(hù)能力有限；二是難以激發(fā)強(qiáng)大且持久的T細(xì)胞免疫應(yīng)答，而這對于清除病毒和預(yù)防慢性感染（如HPV）至關(guān)重要。盡管佐劑（如鋁鹽、MF59）、納米顆粒遞送系統(tǒng)、mRNA平臺等技術(shù)不斷進(jìn)步，但如何實(shí)現(xiàn)抗原在免疫器官中的長效駐留與精準(zhǔn)遞送，以同時(shí)優(yōu)化B細(xì)胞與T細(xì)胞應(yīng)答，仍是疫苗學(xué)領(lǐng)域的圣杯。

熱休克蛋白GP96（亦稱GRP94）作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的關(guān)鍵分子伴侶，因其能結(jié)合多肽并通過CD91（LRP1）等受體激活樹突狀細(xì)胞（DC），促進(jìn)抗原交叉呈遞，從而在抗腫瘤及抗病毒T細(xì)胞免疫中展現(xiàn)出巨大佐劑潛力。然而，其與大分子抗原的結(jié)合模式不明，且促進(jìn)B細(xì)胞應(yīng)答的能力相對較弱，限制了其作為通用疫苗平臺的廣泛應(yīng)用。

在此背景下，本研究創(chuàng)新性地提出了一種抗原-GP96 N端融合策略，構(gòu)建了穩(wěn)定的二聚體納米顆粒疫苗。研究不僅證實(shí)了該平臺能顯著增強(qiáng)抗原穩(wěn)定性與免疫原性，更深入揭示了其通過結(jié)合濾泡樹突狀細(xì)胞（FDC）表面的LRP1受體，形成“替代性抗原滯留”的全新機(jī)制，從而協(xié)同驅(qū)動(dòng)了強(qiáng)大、持久且廣譜的體液與細(xì)胞免疫。以下，我們將從實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果解讀的角度，層層剖析這項(xiàng)研究的科學(xué)內(nèi)涵。

主要技術(shù)
單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序
（技術(shù)服務(wù)伯豪生物提供）

研究結(jié)果
一. 結(jié)構(gòu)引導(dǎo)的理性設(shè)計(jì)：從“松散結(jié)合”到“穩(wěn)固融合”
1. 設(shè)計(jì)原理與驗(yàn)證：
研究首先利用AlphaFold3對包括SARS-CoV-2 RBD、流感HA1、HPV L1在內(nèi)的多種病毒抗原與GP96的結(jié)合模式進(jìn)行了大規(guī)模計(jì)算模擬篩查（圖1A）。結(jié)果顯示，這些抗原主要傾向于結(jié)合GP96的N端結(jié)構(gòu)域（NTD）。因此，團(tuán)隊(duì)決定將抗原融合于GP96的N端，以最大限度地減少空間位阻，確�？乖�表位（如RBD的受體結(jié)合基序RBM）完全暴露（圖1B, C）。

與僅能結(jié)合短肽的天然GP96不同（Supplementary Fig. 2C），這種融合策略利用GP96自身C端的二聚化特性以及RBD的相互作用，形成了在N端和C端均更加緊密的二聚體結(jié)構(gòu)（RBD-GP96-Fusion）。分子動(dòng)力學(xué)模擬證實(shí)，融合后的二聚體構(gòu)象波動(dòng)（RMSD）更小，穩(wěn)定性更高（圖1D, E）。實(shí)驗(yàn)表征顯示，純化的融合蛋白分子量約為231 kDa，符合二聚體預(yù)期（圖1F, G）。透射電鏡直觀展示了RBD-GP96-Fusion形成了更為緊湊的納米顆粒（~10-14 nm），而單獨(dú)的GP96結(jié)構(gòu)則相對松散（圖1H）。質(zhì)譜分析進(jìn)一步揭示了在部分融合蛋白中，兩個(gè)RBD之間可形成二硫鍵，呈現(xiàn)出N端“閉合”與“開放”兩種構(gòu)象（圖1I），這與結(jié)構(gòu)預(yù)測相符。

圖1. 抗原-GP96融合策略的結(jié)構(gòu)引導(dǎo)性設(shè)計(jì)和關(guān)鍵結(jié)構(gòu)的特性：以RBD-GP96融合為例

2. 功能與穩(wěn)定性評估：
關(guān)鍵的是，融合設(shè)計(jì)并未損害抗原本身的生物學(xué)功能。表面等離子共振和ELISA實(shí)驗(yàn)表明，RBD-GP96-Fusion與宿主受體hACE2的結(jié)合親和力與天然的RBD二聚體相當(dāng)，證明RBM表位被完整保留并充分暴露（圖2A, B）。更重要的是，融合顯著提升了抗原的物理穩(wěn)定性和抗酶解能力。納米差示掃描熒光法顯示，融合蛋白的熱聚集溫度顯著高于單獨(dú)的RBD（圖2C）；胰蛋白酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)證明，GP96的存在使融合蛋白在酸性環(huán)境下更能抵抗酶切降解（圖2D）。這種增強(qiáng)的穩(wěn)定性直接轉(zhuǎn)化為了優(yōu)異的體內(nèi)滯留性：活體成像顯示，皮下注射后，RBD-GP96-Fusion在注射部位和引流淋巴結(jié)中的熒光信號滯留時(shí)間遠(yuǎn)超單獨(dú)的RBD或GP96，表現(xiàn)出明顯的“抗原庫”效應(yīng)（圖2E）。

圖2. RBD-GP9-Fusion疫苗的生物穩(wěn)定性和免疫遷移

二、 卓越的免疫原性：驅(qū)動(dòng)強(qiáng)大而持久的體液免疫
1. 高效且持久的抗體應(yīng)答：
在BALB/c小鼠模型中，與鋁佐劑或GP96簡單混合的RBD相比，RBD-GP96-Fusion疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生了顯著更高滴度的抗原特異性IgG、IgG1、IgG2a/b及IgM抗體，且該高水平抗體可維持至少6個(gè)月（圖3B）。更重要的是，它誘導(dǎo)的抗體具有出色的交叉反應(yīng)性，對多種SARS-CoV-2變異株（Alpha, Beta, Omicron等）的S1或RBD蛋白均能產(chǎn)生強(qiáng)效結(jié)合（圖3C, D）。這些抗體不僅結(jié)合力強(qiáng)，功能上也更優(yōu)越：血清表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性（ADCC）報(bào)告活性（圖3E）以及針對原型株和Omicron BA.1活病毒的高滴度中和能力（圖3F）。將此策略應(yīng)用于XBB.1.5毒株RBD，同樣誘導(dǎo)出強(qiáng)大的交叉中和抗體（圖3G）。

2. 長效保護(hù)與記憶形成：
在hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠攻毒實(shí)驗(yàn)中，RBD-GP96-Fusion免疫組展現(xiàn)出顯著的保護(hù)效力：肺部病毒載量更低，且病理切片未見嚴(yán)重肺炎（圖3H-J）。免疫后6個(gè)月，僅在融合疫苗組小鼠的骨髓中檢測到了大量的RBD特異性長壽命漿細(xì)胞（LLPC）（圖3K, L），這是長期體液免疫保護(hù)的基石。值得注意的是，該疫苗幾乎不引發(fā)針對GP96自身的抗體反應(yīng)（Supplementary Fig. 8D），降低了自身免疫風(fēng)險(xiǎn)。

三. 核心機(jī)制：單細(xì)胞分辨率下的“替代性抗原滯留”與免疫細(xì)胞互作圖譜
為了在單細(xì)胞精度上解析融合疫苗的作用機(jī)制，研究團(tuán)隊(duì)對免疫后引流淋巴結(jié)中捕獲了熒光標(biāo)記抗原的細(xì)胞進(jìn)行了單細(xì)胞RNA測序分析。
1. 構(gòu)建抗原結(jié)合細(xì)胞的單細(xì)胞圖譜：
通過流式分選Cy5+的細(xì)胞進(jìn)行scRNA-seq，數(shù)據(jù)經(jīng)過質(zhì)控和聚類后，初步得到了包括B細(xì)胞、T細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞等在內(nèi)的8個(gè)主要細(xì)胞大類（Supplementary Fig. 9D, E），為后續(xù)精細(xì)分析提供了框架。這一方法直接捕捉了與抗原相互作用的細(xì)胞群體，避免了背景噪音。

2. 揭示B細(xì)胞亞群的偏好性結(jié)合：
對B細(xì)胞進(jìn)行亞群重聚類，根據(jù)經(jīng)典標(biāo)記物鑒定出5個(gè)亞群：邊緣區(qū)B細(xì)胞、初始B細(xì)胞、CD69+ B細(xì)胞、生發(fā)中心B細(xì)胞和前GCB細(xì)胞（Supplementary Fig. 10A, B）。分析顯示，RBD-GP96-Fusion蛋白與生發(fā)中心B細(xì)胞的結(jié)合最為顯著（圖3M, N）。差異表達(dá)基因的功能模塊富集分析進(jìn)一步表明，在融合疫苗組中，GC B細(xì)胞上調(diào)的基因模塊主要集中于氨基酸代謝以及與抗原呈遞細(xì)胞形成免疫突觸相關(guān)的通路（Supplementary Fig. 10C, D）。這從轉(zhuǎn)錄組層面提示，融合抗原可能為GC B細(xì)胞提供了更強(qiáng)的活化與代謝重編程信號。

圖3. RBD-GP96-Fusion疫苗誘導(dǎo)IgG滴度魯棒性與GC B細(xì)胞強(qiáng)烈的抗原特異性響應(yīng)

3. 發(fā)現(xiàn)抗原在FDC上的關(guān)鍵錨定細(xì)胞群：
對單核/巨噬細(xì)胞進(jìn)行亞群分析，鑒定出6個(gè)亞群（Supplementary Fig. 15A, B）。其中，濾泡樹突狀細(xì)胞是RBD-GP96-Fusion結(jié)合增加最顯著的群體（圖4A, B）。該群細(xì)胞的差異表達(dá)基因富集在“細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號通路”和“細(xì)胞間黏附的調(diào)節(jié)”等功能模塊（Supplementary Fig. 15C），暗示融合蛋白可能促進(jìn)了FDC與靶細(xì)胞（如B細(xì)胞）間的直接或間接相互作用。單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)為后續(xù)聚焦于FDC的機(jī)制研究提供了關(guān)鍵的細(xì)胞靶點(diǎn)指引。

圖4. RBD-GP96-Fusion疫苗通過GP96和FDC，在GC B細(xì)胞中產(chǎn)生抗原滯留的替代性機(jī)制

4. 解析T細(xì)胞應(yīng)答格局：
同樣，對T細(xì)胞亞群的分析揭示了7個(gè)主要亞群（Supplementary Fig. 23A, B）。與對照組相比，RBD-GP96-Fusion顯著增加了與CD8+ 效應(yīng)T細(xì)胞的結(jié)合（圖5A, B）。這些CD8+ 效應(yīng)T細(xì)胞的差異表達(dá)基因在“白細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性”、“殺傷調(diào)節(jié)”等通路上富集（Supplementary Fig. 23C, D）。此外，利用CellPhoneDB進(jìn)行的細(xì)胞間相互作用分析預(yù)測，在融合疫苗組中，CD8+ 效應(yīng)T細(xì)胞與經(jīng)典樹突狀細(xì)胞之間的通訊信號增強(qiáng)（圖5C）。這些單細(xì)胞層面的發(fā)現(xiàn)，完美銜接并解釋了后續(xù)觀察到的強(qiáng)大細(xì)胞免疫表型。

圖5. RBD-GP96-Fusion疫苗通過增強(qiáng)DC細(xì)胞靶向能力，誘導(dǎo)廣泛而長效的T細(xì)胞響應(yīng)

四. 機(jī)制深化：“替代性抗原滯留”驅(qū)動(dòng)生發(fā)中心B細(xì)胞反應(yīng)
基于單細(xì)胞測序發(fā)現(xiàn)的線索，研究進(jìn)一步在細(xì)胞和分子層面深入探索。
1. 靶向生發(fā)中心B細(xì)胞與FDC：
流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證了scRNA-seq的發(fā)現(xiàn)。免疫后第7天，融合疫苗組小鼠淋巴結(jié)中GC B細(xì)胞及其抗原特異性亞群的比例和數(shù)量均顯著高于對照組（圖3O-Q）。同時(shí)，也誘導(dǎo)產(chǎn)生了更多的抗原特異性記憶B細(xì)胞前體（圖3R）。這些GC反應(yīng)的強(qiáng)度與最終的抗體滴度及中和效價(jià)高度相關(guān)（Supplementary Fig. 13）。

2. 突破經(jīng)典途徑：LRP1介導(dǎo)的抗原錨定
FDC是GC中儲存和呈遞完整抗原給B細(xì)胞的“圖書館”。傳統(tǒng)上，F(xiàn)DC通過其表面的Fc受體或補(bǔ)體受體捕獲抗原-抗體復(fù)合物。本研究發(fā)現(xiàn)了一條全新的抗原遞呈途徑：即使阻斷FcR，RBD-GP96-Fusion在FDC上的富集仍顯著高于RBD對照組（圖4C）。機(jī)制探究表明，GP96能直接結(jié)合FDC表面高表達(dá)的LRP1受體。當(dāng)同時(shí)阻斷FcR和LRP1時(shí)，融合抗原與FDC的結(jié)合幾乎被完全抑制（圖4E-G）。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)了RBD-GP96-Fusion通過GP96-LRP1相互作用錨定在FDC表面（圖4J, K），并且這種結(jié)合能直接橋接FDC與B細(xì)胞（圖4L）。

3. 功能驗(yàn)證：延長B細(xì)胞-FDC互作
延時(shí)活細(xì)胞成像技術(shù)直接觀察到，經(jīng)RBD-GP96-Fusion預(yù)處理的FDC，與GC B細(xì)胞的相互作用時(shí)間顯著延長，而這一效應(yīng)可被LRP1抗體特異性阻斷（圖4M-O）。這為“抗原滯留”提供了直觀的功能證據(jù)。結(jié)構(gòu)模型也顯示，在RBD-GP96-Fusion與LRP1/CD91-α的對接中，RBM表位依然保持暴露（圖4Q）。研究人員進(jìn)一步通過分子動(dòng)力學(xué)模擬和點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)，精細(xì)解析并驗(yàn)證了GP96與CD91-α的關(guān)鍵結(jié)合界面（Supplementary Fig. 21, 22）。

綜上所述，該研究揭示了一個(gè)清晰的機(jī)制通路（圖4R）：RBD-GP96-Fusion憑借GP96增強(qiáng)的穩(wěn)定性，更有效地進(jìn)入淋巴濾泡，其GP96部分通過結(jié)合FDC表面的LRP1，繞過或協(xié)同經(jīng)典FcR/CR途徑，將大量完整抗原長期“錨定”在FDC表面。這種“替代性抗原滯留”為GC B細(xì)胞提供了持續(xù)、高濃度的抗原刺激信號，從而驅(qū)動(dòng)了高強(qiáng)度、高親和力的抗體成熟與長效記憶B/漿細(xì)胞的形成。

五、 強(qiáng)大的交叉性與組織駐留T細(xì)胞免疫
1. 系統(tǒng)性T細(xì)胞應(yīng)答：
融合疫苗同樣極大地提升了細(xì)胞免疫水平。在脾臟中，它誘導(dǎo)了更高水平的Th1型細(xì)胞因子分泌和針對保守表位（如S535-543）的特異性CD8+ T細(xì)胞應(yīng)答（圖5E, F）。這種應(yīng)答在免疫早期即可建立（Supplementary Fig. 25），并能維持長達(dá)6個(gè)月，其間干細(xì)胞樣記憶T細(xì)胞比例顯著升高（Supplementary Fig. 28）。

2. 肺部黏膜免疫與組織駐留記憶：
尤為引人注目的是，RBD-GP96-Fusion疫苗在肺部誘導(dǎo)了強(qiáng)大的黏膜相關(guān)T細(xì)胞免疫。支氣管肺泡灌洗液中，抗原特異性CD8+ IFN-γ+ T細(xì)胞比例急劇上升（圖5G, H），且這些細(xì)胞高表達(dá)歸巢受體CD11a和肺部駐留相關(guān)的CXCR6（圖5I）。在肺組織內(nèi)，疫苗顯著增加了CD69+CD103+的組織駐留記憶T細(xì)胞以及表達(dá)α4β7整合素的T細(xì)胞比例（圖5J, K）。這表明該疫苗能驅(qū)動(dòng)效應(yīng)T細(xì)胞向呼吸道黏膜遷移并定居，形成局部免疫防線。

3. 抗原遞呈機(jī)制：
在分子機(jī)制上，融合疫苗通過GP96-LRP1相互作用，被DC更快速、更大量地內(nèi)吞（圖5M-P）。進(jìn)入細(xì)胞后，抗原經(jīng)由溶酶體/蛋白酶體途徑被加工，肽段被遞送至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，從而高效地通過MHC I類途徑進(jìn)行交叉呈遞，激活CD8+ T細(xì)胞（圖5Q）。

六、 平臺普適性驗(yàn)證：應(yīng)用于HPV疫苗設(shè)計(jì)
為了證明該策略的通用性，研究團(tuán)隊(duì)將其應(yīng)用于人乳頭瘤病毒疫苗設(shè)計(jì)，構(gòu)建了HPV-18 L1-GP96-Fusion 和 E7-GP96-Fusion。

1.  L1疫苗：L1-GP96-Fusion在誘導(dǎo)中和抗體滴度上與經(jīng)典佐劑（AS04， MF59）相當(dāng)或更優(yōu)，且顯著增強(qiáng)了Th1型的IgG2a反應(yīng)和GC B細(xì)胞應(yīng)答（圖6E-I）。更重要的是，它誘導(dǎo)的CD8+ T細(xì)胞應(yīng)答更強(qiáng)，在體外能更有效地殺傷HPV感染的細(xì)胞系，且殺傷效力與CD8+ IFN-γ+ T細(xì)胞頻率正相關(guān)（圖6J-O）。

圖6. 融合策略HPV疫苗L1-GP96-Fusion的設(shè)計(jì)與評估

2.  治療性E7疫苗：E7-GP96-Fusion則展現(xiàn)了卓越的治療性潛能。它誘導(dǎo)了極高水平的CD8+ T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ、顆粒酶B和穿孔素（圖7A-D）。在宮頸癌HeLa細(xì)胞移植瘤模型中，過繼輸注經(jīng)E7-GP96-Fusion免疫小鼠的CD8+ T細(xì)胞，能顯著抑制腫瘤生長、減小瘤重，并導(dǎo)致腫瘤內(nèi)CD8+ T細(xì)胞浸潤大幅增加（圖7E-J），展現(xiàn)了強(qiáng)大的抗腫瘤效果。

圖7. 融合策略HPV陽性腫瘤疫苗E7-GP96-Fusion的設(shè)計(jì)與清除效應(yīng)評估

討論與展望
本研究通過結(jié)構(gòu)引導(dǎo)性的設(shè)計(jì)，將抗原與GP96的N端融合，創(chuàng)造了一個(gè)集抗原穩(wěn)定性增強(qiáng)、靶向性遞送、長效滯留與交叉呈遞促進(jìn)于一體的多功能疫苗平臺。其核心科學(xué)貢獻(xiàn)在于發(fā)現(xiàn)了通過GP96-LRP1軸在FDC實(shí)現(xiàn)“替代性抗原滯留”的新機(jī)制，這為理解如何延長抗原暴露、優(yōu)化GC反應(yīng)提供了全新視角。單細(xì)胞測序技術(shù)的運(yùn)用，不僅無偏地驗(yàn)證了融合抗原對關(guān)鍵靶細(xì)胞（GC B細(xì)胞、FDC、CD8+效應(yīng)T細(xì)胞）的特異性結(jié)合，還從轉(zhuǎn)錄組層面揭示了這些細(xì)胞的功能狀態(tài)變化，為整個(gè)機(jī)制鏈條提供了高分辨率的細(xì)胞學(xué)證據(jù)。

與現(xiàn)有佐劑相比，該平臺具有多重優(yōu)勢：
*   機(jī)制明確：直接靶向LRP1，而非非特異性刺激。
*   效力強(qiáng)大：在誘導(dǎo)抗體廣度、滴度、持久性及T細(xì)胞應(yīng)答（尤其是細(xì)胞毒性CD8+ T細(xì)胞和組織駐留記憶）上，均優(yōu)于鋁佐劑、MF59等。
*   安全性好：炎癥反應(yīng)溫和，不易引發(fā)抗GP96自身抗體。
*   生產(chǎn)可行：蛋白結(jié)構(gòu)相對簡單，易于規(guī)�；�生產(chǎn)。

當(dāng)然，研究也指出了未來方向：如探索鼻內(nèi)等黏膜接種途徑以激發(fā)更強(qiáng)的黏膜IgA應(yīng)答；利用結(jié)構(gòu)生物學(xué)手段精確解析抗原-GP96復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)；將該平臺拓展至流感、腸道病毒等其他難纏病原體。

總而言之，這項(xiàng)研究不僅報(bào)道了一種高效的新型疫苗設(shè)計(jì)策略，更通過深入細(xì)致的機(jī)制探索，為下一代旨在同時(shí)提供長效體液免疫和強(qiáng)大組織駐留T細(xì)胞免疫的疫苗研發(fā)，樹立了一個(gè)重要的范例。其揭示的“替代性抗原滯留”原理，有望廣泛應(yīng)用于抗感染、抗腫瘤等多個(gè)免疫治療領(lǐng)域。

參考文獻(xiàn)：
1. Wang J, Yu W, Shen H, et al (2025) Therapeutic Black Phosphorus Nanosheets Elicit Neutrophil Response for Enhanced Tumor Suppression. Adv Sci (Weinh) 12:e2414779. https://doi.org/10.1002/advs.202414779