在微生物組研究中，16S rRNA基因測(cè)序無疑是探索群落構(gòu)成的基石。然而，傳統(tǒng)的短片段測(cè)序因其長(zhǎng)度限制通常只能測(cè)到16S rRNA的特定區(qū)域，而非整個(gè)基因的全長(zhǎng)序列，導(dǎo)致微生物種類的鑒定在部分菌屬中出現(xiàn)盲區(qū)。而今，PacBio Kinnex 全長(zhǎng)16S rRNA試劑盒的應(yīng)用徹底打破這一局面，不僅以其出色的準(zhǔn)確性和長(zhǎng)讀長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)解決了全長(zhǎng)16S的測(cè)序難題，更借助基于MAS-Seq的Kinnex串聯(lián)技術(shù)，在Vega系統(tǒng)上單張芯片可獲得高達(dá)4000萬條高質(zhì)量全長(zhǎng)16S序列，在Revio系統(tǒng)上更可突破6000萬條，標(biāo)志著全長(zhǎng)16S測(cè)序正式步入高通量、低成本的新紀(jì)元，讓菌種甚至菌株級(jí)別的微生物組分析不再是“奢侈品”。Kinnex 全長(zhǎng)16S測(cè)序技術(shù)基于PacBio的HiFi長(zhǎng)讀長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，實(shí)現(xiàn)對(duì)全長(zhǎng)16S基因的精準(zhǔn)測(cè)序，提供了一把解鎖微生物界更深層奧秘的鑰匙。

1 Kinnex 全長(zhǎng)16S rRNA產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)

更精準(zhǔn)的菌群分類鑒定

長(zhǎng)讀長(zhǎng)可跨越16S rRNA基因的全長(zhǎng)序列（V1-V9），能夠提供更多的信息，其不同區(qū)域的變異性可以用于區(qū)分不同的微生物菌群，使得菌群的鑒定更加精細(xì)準(zhǔn)確，獲得菌種甚至菌株水平的群落組成注釋。

研究表明，與二代16S靶向單個(gè)到三個(gè)亞區(qū)測(cè)序的V4、V6、V1-V3、V3-V5等區(qū)域相比，V1-V9全長(zhǎng)區(qū)域序列對(duì)菌群分類的識(shí)別注釋能力最好，不同的亞區(qū)測(cè)序均在不同的細(xì)菌類群中顯示出分類的偏差¹。

更準(zhǔn)確的變異檢測(cè)

三代長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序可覆蓋二代短讀長(zhǎng)測(cè)序難以檢測(cè)的結(jié)構(gòu)變異，同時(shí)HiFi測(cè)序的準(zhǔn)確率可達(dá)99.9%（Q30），具有生成99.9%相似性的OTU的能力，相比對(duì)于其他方法產(chǎn)生97%相似性的OTU，PacBio較高的測(cè)序質(zhì)量目前使其成為微生物菌種及菌株水平檢測(cè)的更合適的選擇²。

高性價(jià)比

Kinnex 全長(zhǎng)16S rRNA建庫方案采用多樣品混樣和12x 16S gDNA擴(kuò)增子串聯(lián)方式進(jìn)行文庫構(gòu)建，充分利用了HiFi測(cè)序的長(zhǎng)讀長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，大幅提升了全長(zhǎng)16S rRNA測(cè)序的通量，降低了建庫測(cè)序的成本。

2 Kinnex 全長(zhǎng)16S rRNA技術(shù)原理與流程

Kinnex 全長(zhǎng)16S rRNA試劑盒采用MAS-Seq方法來提高PacBio長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序的通量，其通過16S gDNA擴(kuò)增子的串聯(lián)來形成長(zhǎng)片段有序陣列。對(duì)串聯(lián)分子測(cè)序產(chǎn)生的 HiFi reads 進(jìn)行生物信息學(xué)拆分，即可檢索到原始擴(kuò)增子序列。Kinnex全長(zhǎng)16S rRNA建庫流程首先使用與Kinnex Adapter兼容的帶Barcode標(biāo)簽的16S基因特異性正向和反向引物進(jìn)行全長(zhǎng)16S gDNA的擴(kuò)增，其中正向引物具有12種，反向引物有32種，可實(shí)現(xiàn)高達(dá)384種樣本混樣，再將擴(kuò)增后的16S gDNA擴(kuò)增子以12x串聯(lián)方式連接形成有序陣列，并在兩側(cè)添加接頭進(jìn)行文庫構(gòu)建，從而提高通量，減少測(cè)序成本，實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)高效的全長(zhǎng)16S rRNA基因測(cè)序。

3 Kinnex 全長(zhǎng)16S rRNA應(yīng)用案例解析

題目：Assessing the impact of diet formulation and age on targeted bacterial establishment in laboratory and mass-reared Mediterranean fruit fly using full-length 16S rRNA sequencing

研究領(lǐng)域：昆蟲腸道微生物

主要結(jié)果：

昆蟲腸道微生物菌群在宿主健康和與環(huán)境的相互作用中發(fā)揮著重要作用。在實(shí)驗(yàn)室和大規(guī)模飼養(yǎng)的昆蟲中，腸道微生物菌群的組成和功能與野生型相比可能有所不同，而了解影響細(xì)菌在宿主中定植能力的因素對(duì)于在大規(guī)模飼養(yǎng)的昆蟲中植入曾丟失的或新的微生物菌群至關(guān)重要。在近期發(fā)表的一項(xiàng)關(guān)于評(píng)估飼料配方與宿主年齡對(duì)實(shí)驗(yàn)室及大規(guī)模飼養(yǎng)的地中海果蠅腸道中目標(biāo)細(xì)菌定植影響的研究中³，Charles J. Mason等使用不同飼料配方（液體與漿狀）對(duì)新生與7日齡果蠅進(jìn)行腸桿菌菌株接種，菌株帶有抗生素抗性標(biāo)記以便于追蹤，并采用PacBio Kinnex 全長(zhǎng)16S rRNA測(cè)序進(jìn)行高分辨率分析。研究結(jié)果顯示，液體飼料能高效促進(jìn)目標(biāo)菌株在果蠅腸道內(nèi)定植，且效果不受果蠅年齡或品系來源的影響，而漿狀飼料的接種在年齡較大的果蠅中效果較差。通過全長(zhǎng)16S測(cè)序，研究不僅成功追蹤到目標(biāo)腸桿菌菌株的特定序列，還揭示了在屬級(jí)分類之下潛藏的菌株水平多樣性。與傳統(tǒng)的短片段測(cè)序相比，全長(zhǎng)16S測(cè)序展現(xiàn)了更卓越的分辨能力，能夠清晰區(qū)分不同的腸桿菌擴(kuò)增子序列變異（ASV），而這些信號(hào)在僅使用V4或V3-V4區(qū)域測(cè)序時(shí)被降低。研究揭示了利用液體飼料進(jìn)行微生物干預(yù)的潛力，同時(shí)表明了PacBio全長(zhǎng)16S rRNA測(cè)序技術(shù)在解析昆蟲微生物菌群復(fù)雜性和追蹤特定菌株方面具有顯著優(yōu)勢(shì)，為通過微生物菌群管理提升害蟲防治效果提供了新的技術(shù)路徑。

訂購信息

Kinnex 全長(zhǎng)16S rRNA工作流程需要使用Kinnex 16S rRNA kit (103-072-100) 并參考說明書 (103-238-800) 合成16S基因特異性引物進(jìn)行前期16S基因擴(kuò)增和后期建庫流程。

技術(shù)的進(jìn)步，正是為了打破認(rèn)知的邊界。PacBio Kinnex 16S rRNA試劑盒所帶來的，并不僅僅是通量的飆升與成本的優(yōu)化，它更是一次研究范式升級(jí)的契機(jī)。它讓我們能夠以前所未有的精細(xì)度，去審視微生物世界中菌種與菌株的動(dòng)態(tài)變化，推動(dòng)研究從以往模糊的屬級(jí)水平向更為精細(xì)的菌種甚至菌株水平深化。

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參考文獻(xiàn)
1.Johnson, J.S., Spakowicz, D.J., Hong, BY. et al. Evaluation of 16S rRNA gene sequencing for species and strain-level microbiome analysis. Nat Commun 10, 5029 (2019). https://doi.org/10.1038/s41467-019-13036-1.
2.Srinivas, M., Walsh, C.J., Crispie, F. et al. Evaluating the efficiency of 16S-ITS-23S operon sequencing for species level resolution in microbial communities. Sci Rep 15, 2822 (2025). https://doi.org/10.1038/s41598-024-83410-7.
3.Mason CJ, Nelson RC, Weaver M. et al. Assessing the impact of diet formulation and age on targeted bacterial establishment in laboratory and mass-reared Mediterranean fruit fly using full-length 16S rRNA sequencing. Microbiol Spectr 13:e02881-24. (2025). https://doi.org/10.1128/spectrum.02881-24.