編者按

VIB單細(xì)胞中心實(shí)驗(yàn)室的負(fù)責(zé)人Niels Vandamme博士分享了Flex基因表達(dá)分析如何以合理的成本提供操作上的靈活性和可擴(kuò)展性，實(shí)現(xiàn)從脆弱樣本中獲得高質(zhì)量數(shù)據(jù)。此外，他們的“獨(dú)門秘籍”可進(jìn)一步降低實(shí)驗(yàn)成本。

——根特大學(xué)VIB單細(xì)胞中心實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人Niels Vandamme博士

為科學(xué)家掃清研究障礙，充分利用其樣本和預(yù)算，是VIB單細(xì)胞中心實(shí)驗(yàn)室的成員們感到興奮和獲得成就感的源泉。強(qiáng)大的單細(xì)胞技術(shù)（包括Flex基因表達(dá)分析）及多年的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)是這項(xiàng)能力的核心。

近期我們采訪了VIB單細(xì)胞中心實(shí)驗(yàn)室的負(fù)責(zé)人Niels Vandamme博士，請(qǐng)他談?wù)勚行膶?shí)驗(yàn)室如何支持研究人員，以及他們使用Flex分析時(shí)體驗(yàn)到的一些優(yōu)勢(shì)。繼續(xù)閱讀本文，了解Flex帶來(lái)的靈活性，以及Flex如何憑借穩(wěn)健的數(shù)據(jù)質(zhì)量贏得了他們的持續(xù)青睞。同時(shí)，您還將看到他們?nèi)绾瓮ㄟ^(guò)靈活搭配試劑盒這一獨(dú)特方式，為客戶有效降低成本。

作為VIB單細(xì)胞核心實(shí)驗(yàn)室的負(fù)責(zé)人，您在引進(jìn)新技術(shù)時(shí)會(huì)考慮哪些因素？

作為一個(gè)團(tuán)隊(duì)，我們始終響應(yīng)用戶需求，同時(shí)也會(huì)預(yù)判用戶的需求。因此，我認(rèn)為制定一份完整的未來(lái)路線圖至關(guān)重要，可確定哪些需求將得到充分滿足。我們?cè)噲D確定哪些有望成為長(zhǎng)期的技術(shù)和技術(shù)平臺(tái)，以解決當(dāng)前的瓶頸。

在發(fā)現(xiàn)具有顛覆性潛力的技術(shù)時(shí)，我們會(huì)迅速行動(dòng)并嘗試整合。一旦開(kāi)始，我們要驗(yàn)證該技術(shù)是否切實(shí)可行。

Niels Vandamme博士與VIB單細(xì)胞核心實(shí)驗(yàn)室的項(xiàng)目經(jīng)理Ria Roelandt正在使用Hamilton Vantage平臺(tái)。實(shí)驗(yàn)室已在該平臺(tái)上實(shí)現(xiàn)10x Genomics工作流程的全自動(dòng)化，確保單細(xì)胞處理的一致性和可擴(kuò)展性。
 

Niels Vandamme博士與VIB Spatial Catalyst項(xiàng)目的科學(xué)家Elina Kuznecova正在使用Visium CytAssist平臺(tái)，該平臺(tái)支持空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)項(xiàng)目，這些項(xiàng)目由單細(xì)胞核心實(shí)驗(yàn)室和Spatial Catalyst團(tuán)隊(duì)共同維護(hù)和優(yōu)化。

在采用單細(xì)胞測(cè)序開(kāi)展項(xiàng)目時(shí)，與您合作的研究人員最常擔(dān)心或考慮哪些因素？

他們通常擔(dān)心這套工作流程過(guò)于復(fù)雜。我們能輕松調(diào)整和適應(yīng)，并打消他們的顧慮，因?yàn)閱渭?xì)胞核心實(shí)驗(yàn)室作為某種一站式平臺(tái)，可提供從始至終的服務(wù)。我們提供清晰的預(yù)算概覽，以及全套服務(wù)的考慮因素，包括單細(xì)胞分選、測(cè)序和數(shù)據(jù)處理等。

在新項(xiàng)目啟動(dòng)時(shí)，研究人員會(huì)考慮起始量要求和樣本完整性。他們往往擔(dān)心是否能收集足夠的細(xì)胞，或是否有足夠的材料或細(xì)胞核用在項(xiàng)目中。

第二個(gè)考慮因素通常是預(yù)算。是否能在特定的預(yù)算范圍內(nèi)完成實(shí)驗(yàn)？這涉及到研究目標(biāo)與實(shí)驗(yàn)資金之間的權(quán)衡取舍。

近年來(lái)我注意到，另一個(gè)新興關(guān)注點(diǎn)是備受重視的重復(fù)性問(wèn)題。人們不僅要求實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有生物學(xué)意義，還要求多次實(shí)驗(yàn)之間具有可重復(fù)性。

關(guān)于可重復(fù)性，用戶關(guān)心的其他問(wèn)題包括：避免批次效應(yīng)，確保實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)正確，杜絕實(shí)驗(yàn)混雜因素。若他們使用新的分析或化學(xué)試劑，作為核心實(shí)驗(yàn)室，我們有責(zé)任確保重大項(xiàng)目全程使用相同的化學(xué)試劑。

許多用戶低估了數(shù)據(jù)分析與解讀的難度。我們通常將其視為潛在問(wèn)題：分析的復(fù)雜性可能令人望而卻步。為此，我們?cè)跀?shù)據(jù)生成前就早早做好準(zhǔn)備，向用戶解釋實(shí)際上可回答哪些生物學(xué)問(wèn)題，以及需要哪些實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、深度和重復(fù)次數(shù)來(lái)支持這些問(wèn)題。

為了降低分析門檻，我們提供結(jié)構(gòu)化的質(zhì)量控制報(bào)告和標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)包，用戶可在我們的在線可視化瀏覽器中直接查看，這種瀏覽器與Loupe Browser互為補(bǔ)充。我們還提供Seurat培訓(xùn)課程，幫助用戶解讀結(jié)果并微調(diào)分析。同時(shí)我們與內(nèi)部的生物信息學(xué)家緊密合作，讓研究人員從原始數(shù)據(jù)順利過(guò)渡到生物學(xué)見(jiàn)解，避免因技術(shù)復(fù)雜性而迷失方向。

您如何幫助研究人員確定單細(xì)胞測(cè)序項(xiàng)目的合適方案？

我們總是從共同討論開(kāi)始，明確他們的生物學(xué)問(wèn)題以及期望的分辨率。他們想研究哪些物種、組織、細(xì)胞類型和細(xì)胞數(shù)量？他們僅僅需要轉(zhuǎn)錄本還是需要不同方式（CITE-seq、ATAC、多組學(xué)等）？

我們首先要弄清他們的需求，再評(píng)估具體的限制因素。例如，細(xì)胞數(shù)量，特定組織解離的考慮因素，是否涉及到特別難處理的細(xì)胞類型？是否有樣本固定方案可以推遲多個(gè)生物安全級(jí)別的考慮因素？最后，討論往往會(huì)停留在我們能為此項(xiàng)目撥出多少預(yù)算。

隨后我們會(huì)匹配最合適的平臺(tái)：采用液滴技術(shù)？還是采用微孔、平板技術(shù)？此外，是采用靶向方法還是研究整個(gè)轉(zhuǎn)錄組？

咨詢階段可能會(huì)花些時(shí)間。我們?cè)噲D做好充分準(zhǔn)備，因?yàn)槲覀冊(cè)诩?xì)胞分選、分離、特定組織消化方面擁有豐富的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，而且在近8年的項(xiàng)目中通過(guò)核心實(shí)驗(yàn)室和VIB積累了龐大的內(nèi)部數(shù)據(jù)庫(kù)。當(dāng)用戶通過(guò)電子郵件咨詢特定組織時(shí)，我們能準(zhǔn)確預(yù)判可能出現(xiàn)的情況。在咨詢會(huì)議前，我們會(huì)回顧過(guò)往項(xiàng)目，以便充分準(zhǔn)備。同時(shí)我們也希望用戶了解到：我們關(guān)注其細(xì)胞類型的預(yù)期結(jié)果，以及可能出現(xiàn)的陷阱和問(wèn)題。

如果存在重大的限制或顧慮，我們會(huì)建議進(jìn)行試點(diǎn)實(shí)驗(yàn)。例如對(duì)一或兩個(gè)樣本進(jìn)行技術(shù)試點(diǎn)，以便進(jìn)行質(zhì)量控制。

您認(rèn)為Flex基因表達(dá)分析的哪些特點(diǎn)對(duì)核心實(shí)驗(yàn)室常規(guī)開(kāi)展的項(xiàng)目最有價(jià)值？

我認(rèn)為三大特點(diǎn)最為重要。首先是固定和存儲(chǔ)樣本的能力，這為時(shí)間安排提供了靈活性。對(duì)于多中心研究或多地點(diǎn)操作而言，這具有革命性意義，我們核心實(shí)驗(yàn)室本身也是多地點(diǎn)運(yùn)行。這種化學(xué)方法耐受冷凍保存。對(duì)我們來(lái)說(shuō)，確保樣本采集與文庫(kù)制備的環(huán)節(jié)順利脫鉤至關(guān)重要。此外，Flex還展現(xiàn)出卓越的數(shù)據(jù)質(zhì)量。我認(rèn)為其表現(xiàn)超出人們預(yù)期，堪稱頂級(jí)水準(zhǔn)。第三個(gè)促使人們選擇Flex的優(yōu)勢(shì)在于多重分析策略導(dǎo)致成本降低。

我們最先發(fā)現(xiàn)的是固定優(yōu)勢(shì)，之后逐步意識(shí)到它具有極其出色的質(zhì)量和穩(wěn)定性。

我們使用Flex分析已有兩三年了，但從未遇到過(guò)與分析相關(guān)的失敗案例。數(shù)百個(gè)項(xiàng)目中僅有兩次失敗，而且均與樣本相關(guān)。

您認(rèn)為將樣本采集與文庫(kù)制備分開(kāi)能為用戶帶來(lái)哪些好處？Flex分析如何支持這一過(guò)程？

Flex不僅僅是一種化學(xué)方法，它已成為一種賦能的工作流程，將單細(xì)胞分析能力延伸至我們實(shí)驗(yàn)室之外。我們宣傳Flex不僅能測(cè)序樣本，更是存儲(chǔ)樣本的新方式。在我們的研究所和相關(guān)生態(tài)系統(tǒng)中，這自然改變了生物學(xué)家對(duì)樣本保存的看法以及對(duì)未來(lái)分析的意愿。想想人們通常是如何保存生物材料的：快速冷凍組織，使用RNAlater（一種儲(chǔ)存試劑）或固定樣本用于組織學(xué)分析。Flex完全融入了這種思維模式，不過(guò)是針對(duì)單細(xì)胞懸液。

在我們周圍，許多實(shí)驗(yàn)室已常規(guī)生成單細(xì)胞懸液用于流式細(xì)胞術(shù)或分選。因此我們不斷追問(wèn)研究人員：為什么不采用這種后續(xù)可以隨時(shí)測(cè)序的方式來(lái)保存這些懸液？我們向他們分發(fā)小規(guī)格固定試劑盒和單頁(yè)操作方案(1)。

這些是自制的試劑盒，讓每個(gè)樣本獨(dú)立開(kāi)展反應(yīng)。我們提供單獨(dú)的“小盒子”，其中含有10支管。10x Genomics的每種緩沖液均按照單樣本用量分裝。每支管上均標(biāo)明操作步驟（如加入xx µl H2O和xx µl 37% PFA等）。我們還為研究人員提供分裝好的50%甘油溶液，并附帶銷售小規(guī)格的37% PFA試劑管。實(shí)際上，我們?yōu)樗麄兲峁┝怂�有必需品！�?duì)于某些實(shí)驗(yàn)室，我們會(huì)提供一個(gè)大規(guī)格的48反應(yīng)試劑盒，但這種情況很少見(jiàn)。

Vandamme博士慷慨提供了核心實(shí)驗(yàn)室的樣本固定方案(1)。

核心實(shí)驗(yàn)室是否參與了某個(gè)令人興奮的項(xiàng)目或研究成果，其中使用了Flex？

作為核心實(shí)驗(yàn)室，我們并非專注于單個(gè)項(xiàng)目或某一特性的生物學(xué)問(wèn)題。我們參與了數(shù)百個(gè)使用Flex的項(xiàng)目，覆蓋多種組織、樣本類型、細(xì)胞類型等。每個(gè)項(xiàng)目都對(duì)我們具有獨(dú)特意義。所得數(shù)據(jù)和生物學(xué)解讀也不會(huì)局限于我們的平臺(tái)，因此很難輕易斷言我們正專注于某一”突破性“成果。

對(duì)我們而言，技術(shù)突破才是至關(guān)重要的——我們優(yōu)化了工作流程，讓分析變得切實(shí)可行，從而為客戶解鎖新的研究可能——這一刻對(duì)我們至關(guān)重要。一旦瓶頸得以消除，便是我們倍感自豪、也是最具成就感的時(shí)刻。

讓我們感到興奮的成果之一是snPATHO-seq(2)方法。我們將FFPE組織作為Flex分析的起始材料，因此我們確實(shí)能使用生物存檔的材料。這些樣本并非為單細(xì)胞測(cè)序而準(zhǔn)備，在采集和固定這些組織時(shí)，研究人員并未考慮過(guò)開(kāi)展單細(xì)胞測(cè)序。這開(kāi)啟了大量此前無(wú)法使用的新隊(duì)列。

以FFPE作為起始材料，我們正推出人類和小鼠樣本的大量操作方案。胰腺樣本曾讓我們大費(fèi)周折，但如今我們發(fā)現(xiàn)胰腺樣本在Flex分析中的表現(xiàn)優(yōu)于逆轉(zhuǎn)錄分析或單細(xì)胞核。我們還發(fā)現(xiàn)富含中性粒細(xì)胞和粒細(xì)胞等脆弱細(xì)胞類型的樣本也能很好地保存。因此我們對(duì)Flex分析、固定過(guò)程以及單細(xì)胞封裝所用的GEM-X流程充滿信心。我們?cè)?/strong>Flex分析中使用定制探針，如今也使用CRISPR技術(shù)。