Pippin全自動DNA片段回收儀在GUIDE-seq2測序中的應(yīng)用
Pippin 系列全自動DNA片段回收儀用于GUIDE-seq2測序——《Nature》 CRISPR–Cas9 PAM變體研究
- 背景知識：
傳統(tǒng)CRISPR-Cas9被譽為“基因剪刀”，Cas9酶識別的前提是目標(biāo)DNA旁邊存在一個“protospacer adjacent motif”（PAM）序列，但也限制了靶點的選擇范圍。工程化和表征蛋白質(zhì)可能既耗時又繁瑣，“通用型”CRISPR-Cas 酶雖然可以應(yīng)用多樣化的基因組編輯，但這類酶往往脫靶率高、切割效率低。
理想的基因編輯工具，應(yīng)針對特定靶點 “精準(zhǔn)打擊”—— 既可以擴(kuò)大靶向覆蓋，又能夠降低脫靶風(fēng)險，甚至可以實現(xiàn)等位基因特異性編輯。因此，需篩選海量的酶變體并驗證其 PAM 特異性，而傳統(tǒng)實驗方法效率低下，難以應(yīng)對百萬級別的酶庫篩選需求。
2025年4月22日美國麻省總醫(yī)院和哈佛醫(yī)學(xué)院的科學(xué)家們在《Nature》雜志發(fā)表了題為“Custom CRISPR-Cas9 PAM variants via scalable engineering and machine learning”的研究文章，堪稱CRISPR技術(shù)發(fā)展的里程碑。
理想的基因編輯工具，應(yīng)針對特定靶點 “精準(zhǔn)打擊”—— 既可以擴(kuò)大靶向覆蓋，又能夠降低脫靶風(fēng)險，甚至可以實現(xiàn)等位基因特異性編輯。因此，需篩選海量的酶變體并驗證其 PAM 特異性，而傳統(tǒng)實驗方法效率低下，難以應(yīng)對百萬級別的酶庫篩選需求。
2025年4月22日美國麻省總醫(yī)院和哈佛醫(yī)學(xué)院的科學(xué)家們在《Nature》雜志發(fā)表了題為“Custom CRISPR-Cas9 PAM variants via scalable engineering and machine learning”的研究文章，堪稱CRISPR技術(shù)發(fā)展的里程碑。
研究團(tuán)隊通過基于結(jié)構(gòu)/功能的飽和誘變和細(xì)菌篩選，獲得了近 1000 種工程化的SpCas9酶，并對它們的PAM需求進(jìn)行了表征，以此訓(xùn)練一個將氨基酸序列與 PAM 特異性聯(lián)系起來的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。并利用由此產(chǎn)生的 PAM 機器學(xué)習(xí)算法（PAMmla）預(yù)測 6400 萬種 SpCas9 酶的 PAM。PAMmla 將機器學(xué)習(xí)和蛋白質(zhì)工程深度融合，構(gòu)建了一個擁有不同 PAM 需求的 SpCas9 酶資源庫，為開發(fā)更安全、高效的 CRISPR 基因組編輯技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。
在該研究中，GUIDE-seq2 作為全基因組脫靶效應(yīng)評估的核心技術(shù)，主要應(yīng)用于驗證 PAMmla 預(yù)測的定制化 SpCas9 酶的特異性。GUIDE-seq2可作為細(xì)胞水平、無偏好、全基因組范圍捕獲 CRISPR 切割位點的金標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。
- 本文中GUIDE-seq2實驗流程：
- 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與樣本制備：將核酸酶表達(dá)質(zhì)粒、sgRNA 質(zhì)粒、dsODN 標(biāo)簽與轉(zhuǎn)染試劑共轉(zhuǎn)染 HEK 293T 細(xì)胞，72 小時后提取基因組 DNA 并定量。
- 靶向整合驗證：通過 PCR 擴(kuò)增、文庫構(gòu)建和NGS測序，結(jié)合 CRISPResso2 分析，計算 dsODN 標(biāo)簽在靶向位點的整合比例，評估靶向編輯效率。
- GUIDE-seq2 核心反應(yīng)：制備含條形碼和 UMI 的 Tn5 轉(zhuǎn)座體，對基因組 DNA 進(jìn)行標(biāo)簽化反應(yīng)，經(jīng)蛋白酶 K 終止反應(yīng)、磁珠純化后，用特異性引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。
- 文庫質(zhì)控與測序：由Sage Science公司的 Pippin Prep 全自動DNA片段回收儀精準(zhǔn)篩選 250-500bp 片段以純化文庫，去除雜帶，定量后混合為 2nM 最終文庫，使用 Illumina NextSeq1000/2000 測序。
- 數(shù)據(jù)分析：用更新版 GUIDE-seq2 軟件（max_mismatches=6）分析測序數(shù)據(jù)，鑒定全基因組范圍內(nèi)的脫靶位點，對比定制化酶與傳統(tǒng)酶（SpG、SpRY）的脫靶風(fēng)險。
通過PAMmla模型，研究人員預(yù)測了全部6400萬個可能變體的PAM特異性，并從中挑選出針對不同PAM的最優(yōu)變體進(jìn)行實驗驗證。GUIDE-seq2 檢測顯示，定制化酶的靶向范圍更窄，其脫靶位點數(shù)量較傳統(tǒng) “通用型” 酶減少 26%-96%。，脫靶率顯著降低。
美國Sage Science公司的全自動DNA片段回收儀為實驗提供精準(zhǔn)片段篩選功能，為 GUIDE-seq2 等關(guān)鍵實驗提供了高純度、高質(zhì)量的測序文庫。
通過PAMmla預(yù)測的變體在人類細(xì)胞中展現(xiàn)出優(yōu)異的性能，不僅編輯效率高，脫靶風(fēng)險還大幅降低。文中研究團(tuán)隊已將PAMmla模型和ISDE方法開源，提供在線工具（pammla.streamlit.app）與全庫預(yù)測數(shù)據(jù)，研究者輸入目標(biāo) PAM 即可秒級獲得定制酶序列。綜上所述，PAMmla的開發(fā)標(biāo)志著基因編輯工具從"通用型"向"定制型"的轉(zhuǎn)變，為各種基因編輯應(yīng)用提供了更加安全、高效的選擇。為精準(zhǔn)基因治療、安全堿基編輯和單等位基因疾病干預(yù)奠定技術(shù)平臺。
原文鏈接：
https://doi.org/10.1038/s41586-025-09021-y
美國Sage Science公司的全自動DNA片段回收儀為實驗提供精準(zhǔn)片段篩選功能，為 GUIDE-seq2 等關(guān)鍵實驗提供了高純度、高質(zhì)量的測序文庫。
通過PAMmla預(yù)測的變體在人類細(xì)胞中展現(xiàn)出優(yōu)異的性能，不僅編輯效率高，脫靶風(fēng)險還大幅降低。文中研究團(tuán)隊已將PAMmla模型和ISDE方法開源，提供在線工具（pammla.streamlit.app）與全庫預(yù)測數(shù)據(jù)，研究者輸入目標(biāo) PAM 即可秒級獲得定制酶序列。綜上所述，PAMmla的開發(fā)標(biāo)志著基因編輯工具從"通用型"向"定制型"的轉(zhuǎn)變，為各種基因編輯應(yīng)用提供了更加安全、高效的選擇。為精準(zhǔn)基因治療、安全堿基編輯和單等位基因疾病干預(yù)奠定技術(shù)平臺。
原文鏈接：
https://doi.org/10.1038/s41586-025-09021-y
Sage Science是全球領(lǐng)先的全自動核酸電泳片段回收儀的生產(chǎn)廠家，擁有美國技術(shù)專利，各個型號產(chǎn)品可以高效完成不同長度范圍DNA片段的精準(zhǔn)回收，廣泛用于二代測序、三代測序以及多種分子生物學(xué)相關(guān)領(lǐng)域。
環(huán)亞生物科技有限公司作為美國Sage Science公司在中國區(qū)的獨家代理商，自2011年以來將Sage Science的產(chǎn)品線引入國內(nèi)，一直為國內(nèi)用戶提供專業(yè)的全自動核酸片段回收系統(tǒng)的安裝測試、應(yīng)用培訓(xùn)，技術(shù)支持與售后維護(hù)工作，贏得客戶的一致好評與信任。環(huán)亞生物科技有限公司將一如既往的支持越來越多的Sage Science用戶。
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