新型結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡技術(shù)簡化硬件實現(xiàn)近各向同性超分辨成像
超分辨率顯微鏡技術(shù)近年來極大地推動了生物成像的發(fā)展，但如何在所有空間維度上實現(xiàn)各向同性的分辨率一直是一個重大挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)方法往往需要復雜且高度敏感的光學系統(tǒng)，限制了其廣泛應用。本研究提出了一種名為軸向干涉散斑照明結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡（AXIS-SIM）的新技術(shù)，它通過最小程度的硬件修改，利用簡單背反射鏡產(chǎn)生的構(gòu)造干涉來增強軸向分辨率，無需額外的相位控制或復雜光束整形。AXIS-SIM不僅提供了優(yōu)異的光學切片能力，還將軸向分辨率提升至140.1納米，側(cè)向分辨率達108.5納米，實現(xiàn)了接近各向同性的超分辨率成像。此外，該技術(shù)對校準誤差和樣本誘導像差具有強魯棒性，支持多種生物樣本的高通量三維超分辨率成像。實驗展示了其在細胞膜三維形態(tài)可視化、溶酶體和微管的納米級分布解析以及溶酶體運動跟蹤方面的潛力，為生物醫(yī)學研究提供了實用工具。
本論文的重要發(fā)現(xiàn)者包括Hajun Yoo、Kwanhwi Ko、Sukhyeon Ka、Gwiyeong Moon、Hyunwoong Lee、Seongmin Im、Peng Xi & Donghyun Kim。他們共同發(fā)表的論文“Near-isotropic super-resolution microscopy with axial interference speckle illumination”于2025年10月在線發(fā)表在Nature Communications上。
重要發(fā)現(xiàn)
01技術(shù)原理與實驗設計
AXIS-SIM的核心創(chuàng)新在于利用軸向干涉散斑照明來克服三維分辨率各向異性的難題。技術(shù)原理基于在寬場隨機散斑照明顯微鏡基礎上，引入一個銀鏡基底放置在樣本臺上，通過鏡面反射產(chǎn)生干涉效應，從而在軸向方向壓縮散斑點擴散函數(shù)。與傳統(tǒng)隨機散斑照明相比，AXIS照明通過構(gòu)造干涉顯著減少了散斑模式的軸向延伸，提升了光學切片能力。實驗光學系統(tǒng)采用倒置顯微鏡框架，使用488納米和633納米激光源，通過旋轉(zhuǎn)漫射器生成動態(tài)散斑圖案，并由電動納米臺沿z軸進行序列掃描，以層析方式捕獲三維圖像。這種設計不僅簡化了光學布局，還避免了復雜相位控制的需求。
通過有限差分時域模擬和實驗驗證，AXIS照明將軸向有效散斑點擴散函數(shù)的半高全寬從703.5納米降至156.6納米，提升超過四倍。這種軸向約束能力使熒光信號在焦平面方差增大，從而提高了深度分辨精度。實驗中使用水介質(zhì)和約100微米的鏡面間隙來減少像差，并通過軸向畸變校正進一步優(yōu)化成像質(zhì)量。值得注意的是，AXIS-SIM對鏡面傾斜具有魯棒性，模擬顯示即使鏡面傾斜10度，軸向分辨率增強效果仍與完美對齊相當，這降低了實驗設置的復雜性。
02分辨率量化與生物樣本驗證在定量分析中，AXIS-SIM被應用于100納米熒光珠成像，通過62次序列掃描（間隔25納米）獲取三維數(shù)據(jù)。圖像重建采用超分辨率自相關(guān)與兩步去卷積方法，支持不同累積階數(shù)。結(jié)果顯示，AXIS-SIM重建圖像在側(cè)向和軸向上均比衍射極限動態(tài)散斑照明顯微鏡圖像更精細，高階重建能進一步細化細節(jié)。軸向半高全寬減少超過五倍，證實了分辨率顯著增強。相比之下，無鏡面設置會出現(xiàn)重建偽影，凸顯了鏡面在軸向約束中的關(guān)鍵作用。
在生物成像方面，AXIS-SIM被用于活U2OS細胞微管和固定U-87 MG細胞膜蛋白的成像。對于活細胞，掃描間隔40納米，通過磷酸鹽緩沖鹽水介質(zhì)和畸變校正，AXIS-SIM提供了清晰的深度信息，優(yōu)于三維Richardson-Lucy去卷積圖像。微管結(jié)構(gòu)在軸向視圖上顯示出更銳利的細節(jié)，表明顯著的光學切片能力。對于厚固定細胞（約10微米），AXIS-SIM實現(xiàn)了近各向同性超分辨率，空間頻率譜和解相關(guān)分析顯示軸向空間頻率提升超過五倍。此外，通過組合多個感興趣區(qū)域和增大z掃描間隔（200納米），AXIS-SIM支持大體積成像（86.0×53.2×11.7微米³），展示了高通量潛力。
03多色成像與動態(tài)跟蹤AXIS-SIM的多色成像能力通過銀鏡的寬波段反射特性得到驗證，適用于不同激發(fā)波長。在活細胞中，同時對微管（用BioTracker 488 Green標記）和溶酶體（用LysoTracker Deep Red標記）進行成像，AXIS-SIM的三維圖像在側(cè)向和軸向上均比去卷積圖像更清晰，解相關(guān)分析顯示側(cè)向分辨率提升約2.4-2.6倍。實驗成功解析了微管和溶酶體在238納米深度差下的結(jié)構(gòu)，突出了其光學切片優(yōu)勢。
在動態(tài)跟蹤方面，AXIS-SIM能夠捕獲溶酶體的快速細胞內(nèi)運動。通過時間序列成像，定量分析顯示動態(tài)溶酶體的平均速度為79.38納米/秒，其中一些溶酶體在18-24秒間短暫離焦后返回焦平面，體現(xiàn)了高時空分辨率。這種能力使得AXIS-SIM不僅能靜態(tài)解析細胞器形態(tài)，還能跟蹤動態(tài)過程，為細胞生物學研究提供新視角。
創(chuàng)新與亮點
01技術(shù)突破與成像難題解決
AXIS-SIM的核心突破在于解決了超分辨率顯微鏡中長期存在的三維分辨率各向異性問題。傳統(tǒng)技術(shù)如STED或SIM往往在軸向分辨率上受限，導致結(jié)構(gòu)細節(jié)在z軸模糊。AXIS-SIM通過軸向干涉散斑照明，將軸向分辨率提升至140.1納米，側(cè)向分辨率108.5納米，分辨率各向同性比達1.29，接近理想各向同性。這一成就得益于簡單的鏡面干涉設計，無需復雜多物鏡系統(tǒng)或精確相位控制，降低了光學復雜性。與需要數(shù)百幀圖像的傳統(tǒng)超分辨率光學波動成像相比，AXIS-SIM僅需50-100幀每層即可實現(xiàn)高質(zhì)量重建，這歸功于超分辨率自相關(guān)與兩步去卷積方法的整合，減少了光漂白，適用于光敏感生物樣本。
另一個大亮點是AXIS-SIM的魯棒性。實驗證明，它對鏡面傾斜和樣本誘導像差不敏感，支持高通量成像。這種穩(wěn)定性使其在生物醫(yī)學應用中更具實用性，例如在活細胞成像中跟蹤細胞器運動，或在厚組織樣本中解析精細結(jié)構(gòu)。此外，技術(shù)兼容多色成像，銀鏡反射在可見光和近紅外波段均勻，確保了多波長應用的一致性。
02光學生物醫(yī)療價值體現(xiàn)
在生物醫(yī)療領(lǐng)域，AXIS-SIM的價值體現(xiàn)在其能夠提供高分辨率的三維細胞結(jié)構(gòu)可視化，從而推動細胞生物學和疾病研究。例如，溶酶體作為細胞降解關(guān)鍵細胞器，其納米級分布和運動模式通過AXIS-SIM被清晰解析，有助于理解溶酶體相關(guān)疾病機制。技術(shù)的高吞吐量特性支持大體積樣本成像，如整個細胞或組織區(qū)域，為藥物篩選和病理分析提供工具。
從光學工程角度看，AXIS-SIM的簡化設計降低了成本和使用門檻，有望促進超分辨率顯微鏡在臨床和基礎研究中的普及。未來，結(jié)合深度學習重建或非線性熒光效應，可進一步優(yōu)化分辨率各向同性，減少采集時間，最小化光毒性，拓展活體應用。
總結(jié)與展望
AXIS-SIM技術(shù)通過集成背反射鏡和散斑照明，成功實現(xiàn)了近各向同性的超分辨率顯微鏡，在簡化光學設置的同時提升了軸向分辨率。實驗驗證了其在活細胞和固定細胞成像中的高效性，支持多色和動態(tài)跟蹤應用。
論文信息
聲明：本文僅用作學術(shù)目的。
Yoo H, Ko K, Ka S, Moon G, Lee H, Im S, Xi P, Kim D. Near-isotropic super-resolution microscopy with axial interference speckle illumination. Nat Commun. 2025 Oct 20;16(1):9274.
DOI:10.1038/s41467-025-64366-2.
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