WB實(shí)際條帶與預(yù)期不符的原因分析及解決辦法
1、目的蛋白以其他形式存在，最常見(jiàn)的情況
● 翻譯后修飾：如糖基化，常見(jiàn)接受糖基化的氨基酸是絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、天冬酰胺(Asn)和羥賴氨酸(Hydroxylysine)，例如CD2，根據(jù)uniprot顯示，其預(yù)測(cè)分子量應(yīng)該在39kda左右，但是表觀分子量一般在45kDa左右，這是由于CD2多個(gè)位點(diǎn)存在糖基化修飾，實(shí)際實(shí)驗(yàn)中，如果想探究分子量差異是否是由糖基化引起的，可以加入糖苷酶PNGase F切去糖基后，進(jìn)行WB，而除了糖基化以外，還存在磷酸化，泛素化、甲基化、乙�；榷喾N翻譯后修飾。其中，糖基化、乙�；�、甲基化通常是使表觀分子量變大，磷酸化通常不變或變大。
CD2理論分子量39kDa左右
表觀分子量45kDa左右
Uniprot中顯示CD2的糖基化
● 剪切：如Caspase-7存在多種形式：
1）Procaspase-7：Caspase-7的前體形式，分子量約為37kDa；
2）Intermediate caspase-7：中間形式的Caspase-7，分子量約為28kDa；
3）Caspase-7 p20：活化的Caspase-7的片段之一，分子量約為20kDa。
Procaspase-7是Caspase-7的未活化前體形式，具有較大的分子量。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡信號(hào)刺激時(shí)，procaspase通過(guò)自身切割或被其他caspase（如initiator caspases）切割激活，形成較小的活性亞單位這些亞單位結(jié)合在一起形成有活性的異二聚體。這種情況可以設(shè)置誘導(dǎo)組和非誘導(dǎo)組進(jìn)行驗(yàn)證。剪切后的表觀分子量會(huì)變小。
Caspase-7兔單克隆抗體的WB結(jié)果
泳道1: HeLa全細(xì)胞裂解物20ug
泳道2: Jurkat全細(xì)胞裂解物20ug
泳道3: HEK-293全細(xì)胞裂解物20ug
二抗：山羊抗兔IgG,(H+L),1/10000稀釋時(shí)綴合的HRP
預(yù)測(cè)分子量：34kDa
觀察分子量：28,35kDa
暴露時(shí)間：180s
● 多聚體和共價(jià)結(jié)合聚體：如果表觀分子量和預(yù)測(cè)分子量呈現(xiàn)倍數(shù)增長(zhǎng)，需要考慮是否是多聚體，添加還原劑如DTT可以驗(yàn)證是否為非共價(jià)結(jié)合聚體。
2、蛋白異常遷移
● 對(duì)于分子量小于20kDa的蛋白
傳統(tǒng)的Tris-Glycine體系在用于SDS-PAGE（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳）時(shí)，對(duì)于小分子量蛋白質(zhì)的分離效果不佳，主要原因在于以下幾個(gè)方面：
1）離子前峰的影響：在Tris-Glycine體系中，濃縮膠通常使用pH6.8的Tris-HCl緩沖液，而電泳緩沖液和分離膠則使用pH8.3左右的Tris-Glycine緩沖液。當(dāng)電泳開(kāi)始時(shí)，甘氨酸(Glycine)在濃縮膠中的解離度較低，移動(dòng)速度慢，形成一個(gè)移動(dòng)的離子前峰。隨著電場(chǎng)的作用，甘氨酸逐漸解離并加速移動(dòng)，在這個(gè)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的自由十二烷基硫酸根離子(DS-)，這些離子會(huì)與小分子量蛋白結(jié)合，導(dǎo)致它們聚集或變性，從而影響分辨率；
2）低分子量蛋白質(zhì)的遷移問(wèn)題：由于上述原因，小分子量蛋白質(zhì)在通過(guò)濃縮膠進(jìn)入分離膠的過(guò)程中可能會(huì)受到阻礙，導(dǎo)致條帶模糊、拖尾或分辨率降低。特別是在分離小于20kDa的蛋白質(zhì)或多肽時(shí)，這種現(xiàn)象尤為明顯；
3）緩沖系統(tǒng)pH值的影響：Tris-Glycine系統(tǒng)的pH值較高，這可能導(dǎo)致小分子量蛋白質(zhì)在電泳過(guò)程中的某些修飾或降解，進(jìn)一步影響其分離效果。
因此推薦使用Tricine-SDS-PAGE體系對(duì)20kDa以下的小分子量蛋白質(zhì)或多肽進(jìn)行分離。Tricine作為電泳緩沖液成分之一，其pKa值較低(8.15)，使得它在電泳過(guò)程中不會(huì)像甘氨酸那樣產(chǎn)生大量的游離DS-離子，從而減少了對(duì)小分子量蛋白質(zhì)的影響，并且能夠提供更高的分辨率。此外，Tricine-SDS-PAGE通常采用較低濃度的丙烯酰胺凝膠，以適應(yīng)小分子量蛋白質(zhì)的分離需求。
● 蛋白電荷或特殊結(jié)構(gòu)如氨基酸側(cè)鏈的特殊排列方式，電泳時(shí)存在遷移過(guò)快或過(guò)慢的現(xiàn)象。
3、蛋白marker的問(wèn)題
和非預(yù)染marker相比，預(yù)染marker雖然使用更加方便，但是由于偶聯(lián)了染料，也存在分子量偏移的現(xiàn)象，并且同一個(gè)marker在不同的電泳體系中，遷移速度也會(huì)有所偏差。
abs923預(yù)染蛋白Marker(10-245kDa)
4、樣本制備問(wèn)題
● 膜蛋白95度加熱變性會(huì)引起聚集，導(dǎo)致檢測(cè)條帶表觀分子量增大；
● 樣本變性或還原不徹底會(huì)影響抗原表位暴露，進(jìn)而影響其遷移速率，樣本制備時(shí)一定要保證上樣緩沖液足量、在保質(zhì)期內(nèi)、并且要選對(duì)裂解液，看清具體成分；
● 樣本一定要新鮮，有些蛋白極易發(fā)生降解，制備時(shí)要注意。
5、排除以上問(wèn)題，最重要的就是要充分了解自己的樣本是否表達(dá)目的蛋白，以及表達(dá)豐度如何，并且查詢廠家的驗(yàn)證圖，了解抗體的特異性如何。
Wb好物推薦
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類別 |
貨號(hào) |
產(chǎn)品名稱 |
規(guī)格 |
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樣本處理 |
RIPA裂解液(強(qiáng)) |
100mL |
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免疫印跡及免疫沉淀用(WB/IP)裂解液 |
100mL |
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廣譜型蛋白酶抑制劑混合物(不含EDTA,100×DMSO儲(chǔ)液) |
1mL |
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廣譜型磷酸酶抑制劑混合物(100×儲(chǔ)液) |
1mL |
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蛋白定量 |
BCA蛋白定量試劑盒 |
500T |
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上樣 |
上樣緩沖液(2×) |
10mL |
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上樣緩沖液(5×) |
10mL |
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Marker |
預(yù)染蛋白Marker(10-180kDa) |
250uL |
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預(yù)染蛋白Marker(10-245kDa) |
500uL |
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預(yù)染發(fā)光Western Marker |
500uL |
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電泳 |
電泳液(10×) |
1L |
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Tris-Glycine-SDS電泳緩沖液(10×) |
500mL |
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預(yù)制膠 |
Plastic gel、Glass gel等多款預(yù)制膠 |
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凝膠試劑盒 |
彩色PAGE快速凝膠試劑盒(10%) |
1kit |
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彩色PAGE快速凝膠試劑盒(12%) |
1kit |
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彩色PAGE快速凝膠試劑盒(8%) |
1kit |
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轉(zhuǎn)膜 |
PVDF膜(0.45μm) |
1卷 |
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PVDF膜(0.22μm) |
1卷 |
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NC膜(0.45μm) |
1卷 |
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NC膜(0.22μm) |
1卷 |
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電轉(zhuǎn)液(10×) |
100mL |
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封閉 |
脫脂奶粉 |
500g |
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Western Blot快速封閉液 |
500mL |
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一抗孵育 |
WB專用一抗二抗稀釋液 |
100mL |
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WB一抗(3萬(wàn)余產(chǎn)品,多指標(biāo)覆蓋) |
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內(nèi)參抗體 |
Rabbit anti-β-Actin Polyclonal Antibody |
100ug |
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Mouse anti-GAPDH Monoclonal Antibody |
1mL |
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Mouse anti-β-Tubulin Monoclonal Antibody |
1mL |
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二抗 |
Goat anti-Rabbit IgG-HRP Antibody |
500uL |
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Goat anti-Mouse IgG-HRP Antibody |
1mL |
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顯色 |
DAB顯色試劑盒(紫藍(lán)色,WB) |
1kit |
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ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒 |
25mL×2 |
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超敏型ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒 |
25mL×2 |
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極敏型ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒 |
25mL×2 |
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