CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）是細(xì)菌和古菌所使用的一種適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，其通過(guò)記錄和靶向病毒的 DNA 序列來(lái)抵御入侵的病毒。這一機(jī)制已被重新改造為一種簡(jiǎn)單、可靠且用途廣泛的技術(shù)，用于哺乳動(dòng)物及其他生物的基因組編輯，使研究人員能夠?qū)Ω黝惿�物學(xué)過(guò)程和疾病狀態(tài)進(jìn)行研究。

CRISPR篩選是功能基因組學(xué)研究人員不可或缺的工具，但傳統(tǒng)篩選方法既復(fù)雜又耗時(shí)，而且數(shù)據(jù)輸出的分辨率低。傳統(tǒng)篩選實(shí)驗(yàn)使用Bulk RNA 輸入來(lái)評(píng)估所有細(xì)胞的平均基因表達(dá)水平，從而掩蓋了細(xì)胞異質(zhì)性；與之不同的是，單細(xì)胞 CRISPR 篩選技術(shù)能在單細(xì)胞水平上，評(píng)估整個(gè)轉(zhuǎn)錄組中多個(gè)基因以及每個(gè)單獨(dú) sgRNA 的擾動(dòng)效應(yīng)。（圖1）

圖1

如果說(shuō)傳統(tǒng)CRISPR是一把分子剪刀，那么單細(xì)胞CRISPR可謂是一把多功能的瑞士軍刀，可快準(zhǔn)狠的破解生物的多重奧秘。

來(lái)自單細(xì)胞分析引領(lǐng)品牌10x Genomics的Chromium單細(xì)胞CRISPR篩選技術(shù)帶來(lái)了一個(gè)更簡(jiǎn)單、更快速的工作流程，采用Feature Barcode技術(shù)和新一代測(cè)序技術(shù)來(lái)檢測(cè)單鏈向?qū)�RNA（sgRNA），該技術(shù)可評(píng)估慢病毒向?qū)?RNA（sgRNA）轉(zhuǎn)導(dǎo)的單細(xì)胞輸入，提供了一種高通量、可擴(kuò)展的方法，能在同一個(gè)單細(xì)胞中同時(shí)獲取基因表達(dá)譜和 CRISPR 介導(dǎo)的擾動(dòng)表型。（圖2）

圖2  * 包括擾動(dòng)或施加刺激后的培養(yǎng)時(shí)間

10x Genomics最新版GEM-X試劑提供了兩種單細(xì)胞CRISPR篩選實(shí)驗(yàn)方案：應(yīng)用于新鮮樣本的GEM-X 5’ CRISPR Screening，以及應(yīng)用于固定后樣本的GEM-X Flex CRISPR Screening。這兩款產(chǎn)品均能將單細(xì)胞基因表達(dá)分析與CRISPR篩選相結(jié)合，以單細(xì)胞分辨率將CRISPR擾動(dòng)與完整的基因表達(dá)表型直接關(guān)聯(lián)。

GEM-X 5’ CRISPR Screening

采用 Feature Barcode 技術(shù)進(jìn)行 CRISPR 篩選的 Chromium 單細(xì)胞免疫組庫(kù)分析（也稱為單細(xì)胞 5' 端 CRISPR 篩選）提供了一種多組學(xué)研究方法，可從同一個(gè)單細(xì)胞中同時(shí)檢測(cè)基因表達(dá)、CRISPR 向?qū)Х肿�、�?xì)胞表面蛋白和 / 或免疫細(xì)胞克隆型頻率。這種單細(xì)胞 5' 端 CRISPR 篩選方法與大多數(shù) Cas9 CRISPR 載體兼容，且無(wú)需在向?qū)?RNA（sgRNA）中整合特定捕獲序列。

10x Genomics建議每個(gè)靶向向?qū)?RNA（sgRNA）使用100-200個(gè)細(xì)胞，這能確保有足夠的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)力來(lái)判斷擾動(dòng)的顯著性。對(duì)于非靶向向?qū)?RNA（sgRNA），其對(duì)于提供計(jì)算擾動(dòng)所需的基線至關(guān)重要，建議使用 5-10% 的非靶向sgRNA。Chromium 單細(xì)胞 CRISPR 篩選檢測(cè)試劑盒Chromium GEM-X 5’ 芯片的每個(gè)通道上可回收多至 20,000個(gè)細(xì)胞，其中1,000-2,000個(gè)（5%-10%）細(xì)胞為含非靶向向?qū)?RNA（sgRNA）的細(xì)胞。每個(gè)靶向向?qū)?RNA（sgRNA）應(yīng)對(duì)應(yīng) 100-200 個(gè)細(xì)胞。采用這種設(shè)置，使用GEM-X 5’ 芯片的單個(gè)通道即可檢測(cè)約 90-180 個(gè)向?qū)?RNA（sgRNA）。如果您希望檢測(cè)更多種sgRNA，可加大細(xì)胞量，上滿芯片所有8個(gè)通道且回收160,000 個(gè)細(xì)胞，便可進(jìn)行Pooled CRISPR篩選，檢測(cè)約1000個(gè)sgRNA。

【實(shí)驗(yàn)流程】

1. 確認(rèn)sgRNA兼容性

為兼容 Chromium 單細(xì)胞 5' 端 CRISPR 篩選檢測(cè)試劑盒，向?qū)?RNA（sgRNA）需經(jīng)工程改造以適配標(biāo)準(zhǔn) Cas9 系統(tǒng)，圖3 顯示了5’ CRISPR 反轉(zhuǎn)錄引物的結(jié)合區(qū)域。

圖3

CRISPR 逆轉(zhuǎn)錄（RT）引物設(shè)計(jì)于向?qū)?RNA（sgRNA）骨架的高度保守區(qū)域，以實(shí)現(xiàn)對(duì)各類Cas9系統(tǒng)的高兼容性。該序列（5’-CAAGTTGATAACGGACTAGCC-3’）與向?qū)?RNA 骨架序列互補(bǔ)。在進(jìn)行單細(xì)胞CRISPR實(shí)驗(yàn)前，建議將CRISPR 引物序列的反向互補(bǔ)序列，與目標(biāo) sgRNA 向?qū)�文�?kù)進(jìn)行 BLAST 比對(duì)，以確認(rèn)兼容性。上述引物序列的反向互補(bǔ)序列為：5'-GGCTAGTCCGTTATCAACTTG-3'。若向?qū)?RNA 骨架不含上述序列，可設(shè)計(jì)定制化富集引物來(lái)擴(kuò)增特殊向?qū)?RNA。

2.sgRNA捕獲及文庫(kù)構(gòu)建

將帶有條形碼的單細(xì)胞 5'凝膠珠、含有轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的 Master Mix（混合反應(yīng)液）以油（Partitioning Oil）GEM-X 5’ 芯片上混合，即可生成 GEMs（油包水微滴）。GEMs 生成后，凝膠珠立即溶解，油包水內(nèi)細(xì)胞隨之裂解。凝膠珠釋放出寡核苷酸，與細(xì)胞裂解物以及含有逆轉(zhuǎn)錄（RT）試劑和引物混合物的 Master Mix 混合。通過(guò)孵育 GEMs，可同時(shí)從細(xì)胞mRNA 中生成帶有 10x 條形碼的全長(zhǎng) cDNA，并從 sgRNA中生成帶有條形碼的 DNA，進(jìn)而可從這些帶有 10x 條形碼的 cDNA 中構(gòu)建出可用于測(cè)序的基因表達(dá)文庫(kù)和 CRISPR 篩選文庫(kù)（圖4）。

圖4

3.文庫(kù)測(cè)序及數(shù)據(jù)分析

在確定特定擾動(dòng)的效應(yīng)時(shí)，目標(biāo)基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)測(cè)序深度范圍是關(guān)鍵因素。由于特定基因的 UM數(shù)量取決于基因表達(dá)文庫(kù)的整體測(cè)序深度，文庫(kù)的測(cè)序深度越深，可檢測(cè)到的 UMI 就越多（直至基因表達(dá)文庫(kù)達(dá)到飽和狀態(tài)，此時(shí)每增加一次新的測(cè)序讀數(shù)，檢測(cè)到新 UMI 的可能性極低）。特定基因檢測(cè)到的 UMI 數(shù)量越多，其表達(dá)變化被檢測(cè)到且具有顯著性的可能性就越大。下圖（圖5）建議了5’表達(dá)譜、5’ CRISPR等文庫(kù)的最低測(cè)序量。

圖5

使用10x Genomics數(shù)據(jù)分析軟件Cell Ranger 9.0.0版本分析每個(gè)反應(yīng)通道的數(shù)據(jù)，如實(shí)驗(yàn)中大量細(xì)胞上樣到多個(gè)反應(yīng)通道，可使用cellranger aggr流程將生成的多個(gè)輸出結(jié)果匯總在一起。

GEM-X Flex CRISPR Screening

10x Genomics Chromium GEM-X Flex基因表達(dá)分析技術(shù)為固定樣本中的基因表達(dá)檢測(cè)提供了全面且可擴(kuò)展的解決方案。在該檢測(cè)中，10x Genomics公司提供了預(yù)先設(shè)計(jì)的人和小鼠的全轉(zhuǎn)錄組探針panel，用于目標(biāo)基因雜交。您可根據(jù)本文件中的指導(dǎo)設(shè)計(jì)定制化探針，添加到商品化的探針試劑盒中，用于在檢測(cè)基因表達(dá)的同時(shí)檢測(cè)CRISPR 篩選。

1. CRISPR Guide Probe設(shè)計(jì)合成及使用說(shuō)明

用于 GEM-X Flex 基因表達(dá)分析的 CRISPR 向?qū)�探針設(shè)計(jì)請(qǐng)見(jiàn)圖6概述，探針設(shè)計(jì)的序列詳見(jiàn)表1，所使用的 CRISPR LHS 探針 barcode 序列（CR001-CR016）列于表 2 中。

圖6

表1

要設(shè)計(jì)用于GEM-X Flex檢測(cè)的CRISPR向?qū)Р东@定制探針，必須預(yù)先知曉向?qū)Ч羌埽╣uide scaffold）和間隔序列（spacer sequences），探針設(shè)計(jì)參考以下原則：
 · 左側(cè)探針（LHS Probe）包含TruSeq R2、探針條形碼（Probe Barcode）以及一段25 bp的向?qū)Ч羌芑パa(bǔ)序列。TruSeq 接頭可添加CRISPR文庫(kù)的Index。
· CRISPR左側(cè)探針條形碼（LHS Probe Barcode）序列與全轉(zhuǎn)錄組分析（WTA）探針中使用的序列不同，詳見(jiàn)表 2。
· 右側(cè)探針（RHS Probe）包含 5’磷酸基團(tuán)（/5Phos/）、一段 5 bp 的向?qū)Ч羌芑パa(bǔ)序列、一段20 bp的靶向間隔序列互補(bǔ)序列，以及部分Capture Sequence 1（pCS1）。

表2

在多樣本混樣實(shí)驗(yàn)中，每個(gè)左側(cè)探針（LHS Probe）必須帶有唯一的 8 堿基探針條形碼（CR001-CR016；序列詳見(jiàn)表 2），且每個(gè)雜交反應(yīng)的 CRISPR 探針和全轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增（WTA）探針均需使用唯一的探針條形碼對(duì)，即同一 CRISPR 探針條形碼不得與多個(gè) WTA 探針條形碼搭配使用。在單重實(shí)驗(yàn)中，可省略該探針條形碼。

定制探針可從任何寡核苷酸合成供應(yīng)商處訂購(gòu)。10x Genomics已在IDT提供的多種形式定制探針中進(jìn)行了測(cè)試，包括DNA寡核苷酸（標(biāo)準(zhǔn)脫鹽）、Ultramer DNA 寡核苷酸和 oPool 寡核苷酸庫(kù)。在有限的測(cè)試中，所有形式均觀察到了可比較的結(jié)果。

合成探針關(guān)鍵指導(dǎo)原則如下：
· 探針應(yīng)經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)脫鹽處理。
· 無(wú)需進(jìn)行 HPLC 純化。
· 探針應(yīng)重懸于 IDTE（或低 EDTA TE 緩沖液）中。
· 右側(cè)（RHS）探針必須進(jìn)行 5' 磷酸化。
· 帶條形碼的左側(cè)（LHS）探針應(yīng)單獨(dú)訂購(gòu)，采用標(biāo)準(zhǔn)脫鹽形式。
· 右側(cè)（RHS）探針可單獨(dú)以標(biāo)準(zhǔn)脫鹽形式訂購(gòu)，也可作為 oPool 寡核苷酸庫(kù)訂購(gòu)。

使用CRISPR Guide Probe，需首先制備一個(gè)混合的 spike-in 庫(kù)，其中包含終濃度為 40 nM 的各右側(cè)（RHS）探針，以及終濃度為400 nM的帶條形碼的CRISPR 左側(cè)（LHS）探針。在向重懸的細(xì)胞沉淀中加入10x Genomics的人/小鼠全轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增（WTA）探針后，再向樣本中加入2.5 μl該spike-in庫(kù)。

每個(gè)靶向sgRNA建議上樣100–200個(gè)細(xì)胞，以確保有足夠的統(tǒng)計(jì)效力來(lái)確定擾動(dòng)的顯著性。對(duì)于非靶向 sgRNA（其對(duì)提供計(jì)算擾動(dòng)的基線至關(guān)重要），建議上樣500–1000個(gè)細(xì)胞。當(dāng)使用全部16種探針進(jìn)行多重檢測(cè)時(shí)，使用GEM-X Flex檢測(cè)可從每個(gè)反應(yīng)可回收多達(dá)320,000個(gè)細(xì)胞。當(dāng)使用芯片的全部8個(gè)孔（目標(biāo)回收率約為2.5×10⁶個(gè)細(xì)胞）時(shí)，可檢測(cè)的sgRNA總數(shù)（包括非靶向 sgRNA）為12,000–25,000個(gè)。

2.實(shí)驗(yàn)流程及需要準(zhǔn)備的額外試劑

GEM-X Flex基因表達(dá)和CRIPSR檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)流程如下圖（圖7）

圖7

使用GEM-X Flex檢測(cè)試劑盒進(jìn)行CRISPR篩選時(shí)，除GEM-X Flex試劑盒外，還需要以下額外的10x Genomics試劑：
・Dual Index Kit TT Set A 96 rxns, PN-1000215
・Amp Mix，可從GEM-X Single Cell 5' Feature Barcode Kit （PN-1000703）中獲取。
・用戶自備的 TruSeq 引物，引物應(yīng)訂購(gòu)標(biāo)準(zhǔn)脫鹽級(jí)別的產(chǎn)品。

- 正向引物（TruSeq Read 1）：CTACACGACGCTCTTCCGATCT
- 反向引物（TruSeq Read 2）：GTGACTGGAGTTCAGACGTGTG

為進(jìn)行 CRISPR 篩選，需要在原User Guide（CG000789）基礎(chǔ)上對(duì)以下步驟進(jìn)行修改或新增，具體操作請(qǐng)參考10x Technical Note CG000814：
Step 1: Probe Hybridization (Modified)
Step 4: Pre-Amplification PCR (Modified)
New Step: Feature PCR
New Step: CRISPR Screening Library Construction 

3.文庫(kù)測(cè)序及數(shù)據(jù)分析

建議將GEM-X Flex CRISPR 篩選文庫(kù)與基因表達(dá)文庫(kù)混合二者混合，以在測(cè)序過(guò)程中維持核苷酸多樣性。GEM-X Flex 基因表達(dá)文庫(kù)的建議最低測(cè)序深度為 10,000 read Pairs / 細(xì)胞，GEM-X Flex CRISPR 篩選文庫(kù)的建議最低測(cè)序深度為 5,000 read pairs / 細(xì)胞。圖8和圖9 分別展示了兩文庫(kù)結(jié)構(gòu)及測(cè)序讀長(zhǎng)建議。

圖8

圖9

10x Genomics數(shù)據(jù)分析軟件Cell Ranger支持對(duì)單重和多重 Flex+CRISPR 數(shù)據(jù)的分析。在分析多重實(shí)驗(yàn)時(shí)，Multi Config CSV 文件需要同時(shí)指定 WTA（全轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增）和 CRISPR 的探針條形碼，詳情請(qǐng)參見(jiàn) 10x Genomics 支持網(wǎng)站（Flex Gene Expression & Feature Barcode Analysis with Cell Ranger multi (Singleplex & Multiplex) | 10x Genomics）。與目前市場(chǎng)上的 CRISPR 工作流程類似，需要使用特征參考文件（feature reference file）來(lái)識(shí)別不同的前間區(qū)序列鄰近基序（protospacer）。請(qǐng)參照 “5' CRISPR 向?qū)Р东@” 的特征參考示例進(jìn)行操作（Cell Ranger Feature Reference CSV | 10x Genomics）。
 

北京怡美通德科技發(fā)展有限公司是10x Genomics的官方授權(quán)代理商，代理美國(guó)10x Genomics公司生產(chǎn)的Chromium單細(xì)胞測(cè)序建庫(kù)系列產(chǎn)品、Visium空間轉(zhuǎn)錄組系列產(chǎn)品以及Xenium組織空間原位分析系統(tǒng)，提供儀器配套的試劑耗材供貨、產(chǎn)品演示實(shí)驗(yàn)、產(chǎn)品安裝、使用培訓(xùn)以及售前售后技術(shù)咨詢、生物信息學(xué)分析等相關(guān)技術(shù)服務(wù)。

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