總膳食纖維檢測試劑盒使用說明書
簡介：
膳食纖維是一種復(fù)雜的有機物質(zhì)的混合物，包括親水性化合物，如可溶和不可溶的多糖和不可消化的低聚糖，以及一系列不健康的或多或少疏水性的化合物，如角質(zhì)、樹莓和木脂素。本手冊中概述的總膳食纖維測定程序基于Lee等人的方法。以及Prosky等人。（AOAC 991.43、AOAC 985.29、AACC 32-07.01和AACC 32-05.01）。然而，Megazyme全膳食纖維試劑盒中的酶也可用于其他膳食纖維分析方法，如AACC方法32-21.01和AACC方法32-06.01。12,3
原理（總膳食纖維）：
總膳食纖維（TDF）是在干燥和脫脂（如果脂肪含量大于10%）材料的復(fù)樣上測定的。樣品在~100°C下用熱穩(wěn)定α-淀粉酶煮熟，使淀粉凝膠化、水解和解聚；在60°C下與蛋白酶（溶解和解聚蛋白質(zhì)）和淀粉葡萄糖苷酶（將淀粉碎片水解成葡萄糖）一起培養(yǎng)；用四體積乙醇沉淀可溶性纖維，去除淀粉中解聚的蛋白質(zhì)和葡萄糖。過濾殘留物；用78%乙醇、95%乙醇和丙酮洗滌；干燥；稱重。對一份樣品進行蛋白質(zhì)分析，另一份在525°C下培養(yǎng)以測定灰分。TDF是過濾和干燥殘渣的重量減去蛋白質(zhì)和灰分的重量。
Megazyme-TDF檢測試劑盒的主要優(yōu)點是它含有高純度、無干擾活性的酶，并且酶的活性是標(biāo)準(zhǔn)化的。標(biāo)準(zhǔn)化α-淀粉酶活性在抗性淀粉測定中的重要性已得到公認(rèn)。Megazyme淀粉葡萄糖苷酶基本上不含纖維素酶，而其他常用制劑含有嚴(yán)重的這種活性污染，導(dǎo)致β-葡聚糖的溶解和低估。所有的Megazyme TDF酶都以即用、穩(wěn)定的液態(tài)形式供應(yīng)。
范圍：
適用于谷類、果蔬、谷類水果制品及食品。
酶純度和標(biāo)準(zhǔn)化：
采用AOAC方法985.29和991.43和AACC方法32-05.01中推薦的標(biāo)準(zhǔn)，評估了巨酶α-淀粉酶、蛋白酶和淀粉葡萄糖苷酶的有效性和純度。Megazyme耐熱α-淀粉酶（E-BLAAM）的活性為3000 U/mL（Ceralpha法）；蛋白酶的供應(yīng)濃度為50 mg/mL（~350酪氨酸U/mL）；淀粉葡萄糖苷酶的供應(yīng)濃度為200 U/mL（對硝基苯基β-麥芽糖苷甙底物）（或可溶性淀粉3300 U/mL）。這種淀粉葡萄糖苷酶活性是傳統(tǒng)TDF分析中所用濃度的150%，因此在分析中使用0.2毫升（而不是0.3毫升）。
Megazyme淀粉葡萄糖苷酶（E-AMGDF）基本上不含纖維素酶，而在用于TDF測定的其他制劑中，纖維素酶污染可高達淀粉葡萄糖苷酶的1%（以活性計）。這種程度的污染導(dǎo)致β-葡聚糖的低估率高達10-15%。
巨酵素酶的測量和標(biāo)準(zhǔn)化方法可根據(jù)要求提供。
TDF檢測試劑盒：
Megazyme提供100/200分析試劑盒，其中包含完整的分析方法以及：
100測定試劑盒（cat。不。K-TDFR-100A）
200測定試劑盒（cat。不。K-TDFR-200A）
瓶子3：（x 2）純化淀粉葡萄糖苷酶（20毫升，可溶性淀粉3300 U/mL）（Megazyme cat。編號：E-AMGDF）。
分析級硅藻土，100 g或500 g包裝，可單獨購買（類別。編號G-CEL-100G或cat。編號G-CEL-500G）。®
TDF檢測對照試劑盒（）：K-TDFC公司
該試劑盒與TDF分析試劑盒一起使用，以確定酶的有效性和純度。該試劑盒包含下列每種成分的一小瓶和一份技術(shù)數(shù)據(jù)表（K-TDFC；膳食纖維對照品）。
該試劑盒中包含的每種成分的量足以進行至少10次分析。
方法1：
總、可溶性和不溶性膳食纖維的測定
根據(jù)AOAC方法991.43“總、可溶和不溶
《食品中的膳食纖維》（1991年第一次行動）和AACC法
32-07.01“食品和食品中可溶性、不溶性和總膳食纖維的測定”（最終批準(zhǔn)10-16-91）。
定義：
本方法是對AACC總膳食纖維（TDF）法（32-05.01）和AACC可溶性/不溶性膳食纖維法（燕麥制品）32-21.01（見第9頁注1）的簡化修改
1. 簡單地說，1g干燥食品樣品（復(fù)制品）通過熱穩(wěn)定α-淀粉酶、蛋白酶和淀粉葡萄糖苷酶進行連續(xù)酶消化。
2. 過濾不溶性膳食纖維（IDF），然后用溫蒸餾水洗滌殘留物。用4體積95%乙醇（EtOH）沉淀濾液和水洗液的混合液，測定可溶性膳食纖維（SDF）。然后過濾沉淀物并干燥。SDF和IDF殘基均針對蛋白質(zhì)、灰分和空白進行校正，以便最終計算SDF和IDF值。
3. 用EtOH沉淀SDF，然后過濾、干燥和稱重殘留物�？偵攀忱w維（TDF）值根據(jù)蛋白質(zhì)和灰分含量進行校正。
經(jīng)美國谷物化學(xué)家協(xié)會許可再版，美國明尼蘇達州圣保羅市。
范圍：
本方法測定加工食品和原材料（如谷類產(chǎn)品、水果和蔬菜）中的可溶性、不溶性和總膳食纖維含量。
儀器：
1. 400 mL和600 mL高的燒杯。
2. 熔塊坩堝，Gooch，熔塊盤，Pyrex50 mL，孔徑粗，ASTM 40-60µm，康寧諾。32940-50C或同等產(chǎn)品。準(zhǔn)備如下：®®
a、 在525°C下在馬弗爐中過夜。
b、 用真空除去硅藻土和灰燼材料。
c、 室溫下，在2%微量清潔溶液（試劑7，第5頁）中浸泡1h。
d、 用水和去離子水沖洗坩堝。
e、 對于最終沖洗，使用15 mL丙酮并風(fēng)干。
f、 向干燥坩堝中添加約1.0 g硅藻土，并在130°C下干燥至恒重。
g、 在干燥器中冷卻坩堝約1小時，并記錄含有硅藻土的坩堝的重量。
3. 過濾瓶，厚壁，帶1L側(cè)臂。
4. 過濾瓶用橡膠環(huán)適配器。
5. 真空源：真空泵或抽氣器，帶有可調(diào)節(jié)真空的調(diào)節(jié)器。
6. 大容量（20-24升）帶蓋水浴槽；能夠保持100°C的溫度；配有自動定時器，用于開關(guān)操作。
7. 天平，0.1mg精度。
8. 兩個機械對流烘箱，設(shè)置為103±2°C和130±3°C。
9. 定時器。
10. 帶SiO或同等干燥劑的密閉干燥器。干燥劑每兩周在130°C烘箱中干燥一夜。2
11. pH計。
12. 容量為50μL和5μL的移液管。
13. 分配器
a、 對于78%EtOH、95%EtOH和丙酮，15±0.5 mL。
b、 緩沖液40±0.5 mL。
14. 量筒，500毫升。
15. 磁力攪拌器和攪拌棒。
16. 橡膠抹刀。
17. 馬弗爐，525±5°C。
試劑：
1. 乙醇，95%v/v。
2. 乙醇，78%。將821 mL 95%v/v乙醇放入1 L容量瓶中。用去離子水稀釋至一定體積�；旌暇鶆�。檢查液位，如有必要，添加更多去離子水，使其恢復(fù)至1L標(biāo)記。
3. 丙酮，試劑級。
4. TDF分析用酶（巨酵素）。儲存在0-5°C。
a、 α-淀粉酶，熱穩(wěn)定（E-BLAAM）；3000 Ceralpha單位/mL。
b、 蛋白酶（E-BSPRT）；50毫克/毫升；350個酪氨酸單位/毫升。
c、 淀粉葡萄糖苷酶（E-AMGDF）；200 pNPβ-麥芽糖苷單位/mL（或可溶性淀粉3300單位/mL）。
5. 去離子水。
6. Celite，分析級（Megazyme cat。編號G-CELI）。®TE公司
7. 清潔溶液，Micro（國際產(chǎn)品公司，新澤西州特倫頓）。用去離子水配制2%溶液。
8. MES/TRIS緩沖液，每個0.05 M，24°C時pH值8.2。溶解
19.52 g 2（N-嗎啉基）乙磺酸（MES）（Megazyme cat。編號B-MES250）和12.2 g三羥甲基氨基甲烷（tris）（Megazyme cat。1.7升去離子水。用6.0 N NaOH將pH調(diào)至8.2。用水稀釋至2升。重要的是將緩沖液的pH值在20°C時調(diào)整到約8.3，或在27-28°C時調(diào)節(jié)到大約8.1。
9. 鹽酸溶液，0.561 N。將93.5 mL 6 N HCl加入1 L容量瓶中約700 mL水中。用水稀釋至1升。
10. pH標(biāo)準(zhǔn)。pH值為4.0、7.0和10.0的緩沖溶液。
酶純度：
為了確保有適當(dāng)?shù)拿富钚院蜎]有不良的酶活性，在整個程序中運行下列材料。每一批新的酶都要檢測，之前6個月沒有檢測過的酶也要檢測。
或者，酶活性和純度可以通過本手冊第17頁和第18頁總結(jié)的分析程序來確定。
一 該活動不應(yīng)出現(xiàn)在測試中。該活動應(yīng)在測試中完全發(fā)揮作用。由于柑橘果膠的不完全沉淀，其值較低。bc
d這種材料含有高水平的“抗酶”淀粉。準(zhǔn)確的預(yù)期回收值將受到試驗中使用的耐熱α-淀粉酶水平的影響。
程序：
1空白
每次分析時，將兩個空白與樣品一起放在一起，以測量試劑對殘留物的貢獻。
2樣品
a、 準(zhǔn)確稱取復(fù)制的1.000±0.005 g樣品于400 mL高型燒杯中。
b、 向每個燒杯中添加40毫升MES-TRIS混合緩沖溶液（pH值8.2）。在每個燒杯中加入磁力攪拌棒。在磁力攪拌器上攪拌，直到樣品完全分散在溶液中（這可以防止塊狀物的形成，這會使樣品無法被酶吸收）。
三。熱穩(wěn)定淀粉酶孵育α
a、 加入50µL熱穩(wěn)定α-淀粉酶溶液，同時低速攪拌。
b、 在每個燒杯上蓋上鋁箔方塊。
c、 將蓋好的樣品置于98-100°c的振蕩水浴中，持續(xù)攪拌培養(yǎng)30分鐘。一旦所有燒杯都在熱水浴中，開始計時。
4很酷
a、 從熱水浴中取出所有樣品燒杯并冷卻至60°C。
b、 拆下箔蓋。
c、 如有必要，用抹刀刮掉燒杯周圍的任何環(huán)和燒杯底部的凝膠。
d、 用移液管用10毫升蒸餾水沖洗燒杯和抹刀的側(cè)壁。
e、 將熱水從浴槽中排出60°C的熱水。
5蛋白酶孵育
a、 向每個樣品中添加100µL蛋白酶溶液。
b、 重新蓋上鋁箔。
c、 在60±1°c的振蕩水浴中孵育，持續(xù)攪拌30分鐘，水浴溫度達到60°c時開始計時。
6pH值檢查
a、 從振蕩水浴中取出樣品燒杯。
b、 拆下蓋子。
c、 攪拌時，向樣品中加入5ml 0.561N HCl溶液。
d、 檢查pH值，應(yīng)為4.1-4.8。如有必要，可使用額外的5%NaOH溶液或5%HCl溶液調(diào)整pH值（見第10頁注2）。
7淀粉葡萄糖苷酶孵育
a、 在磁力攪拌器上攪拌的同時加入200微升的淀粉葡萄糖苷酶溶液。
b、 更換鋁蓋。
c、 在60°c的振蕩水浴中培養(yǎng)30分鐘，并持續(xù)攪拌。水浴溫度達到60°C時開始計時。
A、 不溶性膳食纖維
8過濾裝置
a、 將含有硅藻土的坩堝去皮，精確至0.1 mg。
b、 使用大約3毫升蒸餾水在坩堝中潤濕和重新分配硅藻土層。
c、 對坩堝施加抽吸，將硅藻土拉到熔塊玻璃上，形成均勻的墊子。
9過濾酶混合物從步驟7通過坩堝進入過濾瓶。
10洗滌殘渣用預(yù)熱到70°C的10毫升蒸餾水兩次。在清洗坩堝中的殘留物之前，用水沖洗燒杯。保存濾液和水洗液以測定SDF。將溶液轉(zhuǎn)移到預(yù)先去皮的600 mL高型燒杯中（對于SDF測定，請參閱第8頁SDF程序的第11步）。
11洗滌殘渣用10毫升：
a、 95%乙醚
b、 丙酮
12干坩堝在103°C烘箱中過夜。
13冷坩堝在干燥器中放置約1小時。稱量含有膳食纖維殘留物和硅藻土的坩堝，精確到最近
0.1毫克。減去皮重，即。
干燥坩堝和硅藻土的重量。
14蛋白質(zhì)和灰分測定。
對每種纖維的一個殘留物進行蛋白質(zhì)分析，并對第二個殘留物進行灰分分析。
a、 用凱氏定氮法對殘留物進行蛋白質(zhì)分析。所有情況下使用6.25因子計算蛋白質(zhì)g。
b、 對于灰分分析，在525°C下將第二個殘渣焚燒5小時。在干燥器中冷卻并稱重，精確至0.1 mg。減去坩堝和硅藻土重量，以確定灰分含量（見第10頁注3）。
B、 可溶性膳食纖維
1-10頁。遵循IDF方法的步驟1-10。1-10頁。遵循IDF方法的步驟1-10。
11稱IDF程序步驟10中預(yù)去皮燒杯中濾液和水洗液的混合溶液。
12SDF沉淀
a、 添加4份預(yù)熱至60°C的95%EtOH。使用一部分EtOH從IDF程序中沖洗過濾瓶（步驟10）。或者，將濾液和水洗液的混合溶液的重量調(diào)整至80 g，并添加320 mL預(yù)熱（60°C）95%EtOH。
b、 讓沉淀在室溫下形成60分鐘。
13過濾裝置
a、 將含有硅藻土的坩堝去皮，精確至0.1 mg。
b、 在坩堝中用15毫升78%乙醇從洗滌瓶中潤濕并重新分配硅藻土層。
c、 對坩堝施加抽吸，將硅藻土拉到熔塊玻璃上，形成均勻的墊子。
14過濾
a、 通過坩堝過濾SDF步驟12中沉淀的酶消化物。
b、 使用含78%乙醚的洗滌瓶和橡膠抹刀，將所有剩余顆粒定量轉(zhuǎn)移到坩堝中。
15洗
使用真空，依次用以下兩份15毫升的溶液清洗殘留物：（見第10頁注4）。
a、 78%環(huán)氧乙烷
b、 95%乙醚
c、 丙酮
16干坩堝在103°C烘箱中過夜。
17繼續(xù)IDF方法的步驟13和14。
C、 總膳食纖維
1-7頁。遵循步驟1-7。1-7頁。遵循步驟1-7。
8用EtOH沉淀膳食纖維。
a、 向每個樣品中加入225毫升95%乙醇，預(yù)熱至60°C。加熱后測量體積。乙醇體積與樣品體積之比應(yīng)為4:1。如果95%的EtOH意外過熱至65°C，則添加228 mL用于擴大酒精體積調(diào)節(jié)。
b、 用大鋁箔覆蓋所有樣品。
c、 讓沉淀在室溫下形成60分鐘。
9繼續(xù)執(zhí)行SDF程序的步驟13-17。
計算：
膳食纖維(%) =
來自：R=m中的殘留物重量1；R=m中的殘留物重量2 m=樣品重量1；m=樣品重量21122 12
A=來自R的灰分重量；p=來自R和12
來自：
BR=空白殘留物；BP=來自BR BA的空白蛋白質(zhì)=BR的空白灰分。12
提示：這些計算可以通過使用Megazyme Mega Calc來簡化，可以從Megazyme網(wǎng)站上的產(chǎn)品下載(www.megazyme.com網(wǎng)站).TM公司
注意：
1. 本方法與AACC方法32-05.01和32-21.01的區(qū)別如下：
a、 使用40 mL MES-TRIS緩沖液，每個0.05 M，24°C時pH值8.2，而不是50 mL磷酸鹽緩沖液，0.08 M，pH 6.0。
MES-TRIS緩沖液的pH值隨溫度變化。
MES-TRIS緩沖液（即24°C時為8.2）的pH值在
85-90°C和7.4-7.6（55-60°C）。注意，熱穩(wěn)定α-淀粉酶的最適pH值從60°C時的pH 6.0移動到90°C時的pH 7.0。
b、 由于此處使用的酶活性更高，使用的耐熱α-淀粉酶的體積已從200µL減少到50µL。
c、 如有必要，刮掉燒杯周圍在熱穩(wěn)定α-淀粉酶培養(yǎng)后留下的任何環(huán)。在熱穩(wěn)定α-淀粉酶孵育后，用移液管加入10ml水沖洗抹刀和燒杯側(cè)壁。
d、 蛋白酶作用不需要調(diào)節(jié)pH值，因此培養(yǎng)液中不添加NaOH。
e、 對于淀粉葡萄糖苷酶的作用，添加5 mL 0.561 N HCl溶液。
f、 對于TDF測定，沉淀步驟中添加的95%EtOH的量為225 mL，而不是280 mL。對于SDF/IDF測定，濾液和洗滌液的重量調(diào)整為80 g，而不是100 g。因此，在60℃下添加320 mL 95%EtOH�；蛘�，稱取濾液和洗滌液的混合液并加入4 vol。95%乙醇。通過此修改，總過濾體積減少到375-400 mL（參見第11頁和第12頁圖1和2）。
2. 由于溶液的pH值在較低溫度下會增加，因此在60°C水浴中放置燒杯直到其準(zhǔn)備好進行pH值調(diào)整。一般情況下，大多數(shù)燕麥、大麥、小麥和玉米制品不需要額外的pH調(diào)節(jié)（用5%的HCl或5%的NaOH）。對于此類已知產(chǎn)品，在向樣品中添加5 mL 0.561 N HCl后，可以跳過pH檢查程序。建議將空白溶液pH值的常規(guī)檢查作為災(zāi)難性檢查。如果空白不在理想的pH值范圍內(nèi)，也應(yīng)檢查樣品。
3. 有一些跡象表明，延遲用95%的EtOH和丙酮清洗IDF殘留物可能會導(dǎo)致IDF值膨脹。因此，建議在SDF/IDF程序結(jié)束時不要沖洗IDF殘留物。
4. 在一些樣品中，會形成樹膠，從而捕獲液體。如果出現(xiàn)這種情況，用抹刀將薄膜層弄碎。
參考文獻：
1. Lee，S.C.，Prosky，L.和DeVries，J.W.（1992年）。食品中總可溶性和不溶性膳食纖維的測定.酶重量法，MES-TRIS緩沖液：協(xié)作研究。J、 助理關(guān)閉。肛門�！痘瘜W(xué)》，75395-416。
2. 普羅斯基，L.，Asp，N.G.，施維澤，T.F.，德弗里斯，J.W.和弗爾達，I.（1988年）。食品和食品中不溶性、可溶性和總膳食纖維的測定：實驗室間研究。J、 助理關(guān)閉。肛門。《化學(xué)》，711017-1023。
3. 普羅斯基，L.，Asp，N.G.，施維澤，T.F.，德弗里斯，J.W.和弗爾達，I.（1992年）。食品和食品中不溶性和可溶性膳食纖維的測定：合作研究。J、 助理關(guān)閉。肛門。
化學(xué)。, 75, 360-367.
圖1。總膳食纖維測定程序的分析方案。
圖2.可溶性和不溶性膳食纖維測定程序的分析方案。
方法2：
總膳食纖維的測定
根據(jù)AACC方法32-05.01和AOAC方法985.29。
儀器：
1. 分配器
a、 對于95%乙醇，280±2.0 mL。
b、 78%乙醇、95%乙醇和丙酮為10±0.5 mL。
c、 緩沖液為50±0.5 mL。
2. 所有其他設(shè)備如本手冊第4頁所述。
試劑：
1. pH值為6.0.08的磷酸鹽緩沖液。將1.400 g無水磷酸二鈉（或1.753 g二水合物）和9.68 g一水磷酸二鈉（NaHPO）（或10.94 g二水合物）溶解在約700 mL蒸餾水中。用水稀釋至1升。用pH計檢查pH值。2424
2. 氫氧化鈉溶液，0.275 N。使用適當(dāng)?shù)奶幚眍A(yù)防措施，將11.00 g ACS級NaOH溶解在約700 mL蒸餾水中，并放入1 L容量瓶中。冷卻并用水稀釋至一定體積。
3. 0.325N鹽酸溶液。在容量瓶中用水將已知滴定度的儲備溶液（即325 mL 1.0 N HCl）稀釋至1 L。
程序：
樣品制備
總膳食纖維應(yīng)以干燥、低脂或無脂樣品為基礎(chǔ)進行測定。使樣品均勻化，并在70°C真空烘箱中干燥過夜。在干燥器中冷卻，重新稱重并記錄干燥過程中的重量損失。將干燥樣品的一部分干燥至0.3-0.5 mm的篩網(wǎng)。如果樣品不能加熱，則在研磨前冷凍干燥。如果高脂肪含量（>10%）妨礙正確研磨，則在研磨前用石油醚脫脂三次，每次25毫升（每克樣品）。分析混合膳食時，在測定總膳食纖維之前，一定要先提取脂肪。記錄因脂肪導(dǎo)致的體重減輕。正確測定去除水分和脂肪的最終膳食纖維百分比。將干燥研磨后的樣品儲存在干燥器中的加蓋罐中，直到分析開始。
方法
在整個過程中使用空白樣品，以測量從試劑到殘留物的任何貢獻。
1. 稱取兩份1g樣品，精確至0.1mg，放入400ml高型燒杯中。樣品重量的差異應(yīng)小于
彼此各20毫克。向每個燒杯中添加50毫升磷酸鹽緩沖液（pH 6.0），并用pH計檢查pH值。如果pH值不等于6.0±0.1，則進行調(diào)整。
2. 加入50µL熱穩(wěn)定α-淀粉酶溶液。
3. 在燒杯上蓋上鋁箔，放入沸水浴中。燒杯必須在98-100°C下培養(yǎng)15分鐘。每隔5分鐘輕輕搖動。
注：當(dāng)槽中燒杯的數(shù)量使燒杯內(nèi)容物難以達到98-100°C的內(nèi)部溫度時，應(yīng)增加培養(yǎng)時間。使用溫度計指示
在98-100°C下達到15分鐘。在沸水浴中總共30分鐘應(yīng)足夠。
4. 室溫下冷卻溶液。
5. 通過添加10 mL 0.275 N NaOH溶液將pH值調(diào)整至7.5±0.1。用pH計檢查pH值。
6. 加入100µL蛋白酶溶液。
7. 用鋁箔蓋住燒杯，在60°C下培養(yǎng)，連續(xù)攪拌30分鐘。
8. 冷卻并添加10 mL 0.325 N HCl溶液，以調(diào)節(jié)pH至
4.5±0.2。用pH計檢查pH值。
9. 加入200µL淀粉葡萄糖苷酶，蓋上鋁箔，在60°C下連續(xù)攪拌培養(yǎng)30分鐘。
10. 添加280毫升95%乙醇，預(yù)熱至60°C（加熱前測量體積）。讓沉淀在室溫下形成
60分鐘。
11. 稱取含有硅藻土的坩堝，精確至0.1 mg，然后使用洗滌瓶中78%的EtOH氣流濕潤并分配坩堝中的硅藻土層。
12. 用吸力將硅藻土拉到燒結(jié)玻璃上，使其成為均勻的墊子。保持吸力，并將沉淀從酶消化液中定量轉(zhuǎn)移到坩堝中。
13. 用三份20ml的
78%乙醇，兩份10毫升95%乙醇和兩份
10毫升丙酮。在某些情況下，可能會形成牙齦
過濾過程中，將液體截留在殘渣中。如果是這樣，用抹刀打破表面薄膜，以提高過濾效果。在整個過濾過程中，小心的間歇抽吸可以避免較長的過濾時間。
14. 在70°C真空烘箱或105°C空氣烘箱中干燥含有殘留物的坩堝過夜。
15. 在干燥器中冷卻并稱重，精確至0.1 mg。減去坩堝和硅藻土的重量，以確定殘留物的重量。
16. 采用AACC方法46-13，以N×6.25為轉(zhuǎn)換因子，分析一組重復(fù)樣品中的蛋白質(zhì)殘留。
17. 在525°C下將第二份殘留物樣品焚燒5 h。在干燥器中冷卻并稱重至0.1 mg。減去坩堝和硅藻土重量以測定灰分。
圖3。總膳食纖維分析方案。
計算：
如果在樣品制備步驟中對樣品進行脫脂或干燥，則對脂肪和/或水的最終%TDF進行校正。
提示：這些計算可以通過使用Megazyme Mega Calc來簡化，可以從Megazyme網(wǎng)站上的產(chǎn)品下載(www.megazyme.com網(wǎng)站). 另請參閱本手冊第9頁。TM公司
參考文獻：
1. 官方分析化學(xué)家協(xié)會。（1985年）。官方分析方法，第14版，補遺1期。秒。43，A14-43，A20，第399頁。
2. 官方分析化學(xué)家協(xié)會（1986年）。方法的改變。J、 助理關(guān)閉。肛門�！痘瘜W(xué)》，69370。
3. 官方分析化學(xué)家協(xié)會（1987年）。方法的改變。J、 助理關(guān)閉。肛門。化學(xué)，70，393。
4. 普羅斯基，L.，Asp，N.G.，弗爾達，I.，德弗里斯，J.W.，施維澤，T.F.和哈蘭，B.F.（1985年）。食品和食品中總膳食纖維的測定：合作研究。J、 助理關(guān)閉。肛門�；瘜W(xué)，68677。
5. 普羅斯基，L.，Asp，N.G.，施維澤，T.F.，德弗里斯，J.W.和弗爾達，I.（1988年）。食品和食品中不溶性、可溶性和總膳食纖維的測定。J、 助理關(guān)閉。肛門�！痘瘜W(xué)》，711017。
活性和純度的測量
用于總膳食纖維測量的酶
為了成功應(yīng)用AACC/AOAC國際膳食纖維分析程序，所用的酶必須具有所需的活性，并且沒有重要的污染活性。迄今為止遇到的一些問題包括：
a、 纖維素酶、木聚糖酶和果膠酶污染淀粉葡萄糖苷酶（導(dǎo)致β-葡聚糖、阿拉伯木聚糖和果膠降解和低估）。
b、 不同濃度的耐熱α-淀粉酶（影響抗性淀粉的測量）（見參考文獻1）。
c、 蛋白酶受到1,3:1,4-β-葡聚糖酶的污染（導(dǎo)致對β-葡聚糖的低估）。
所需活動的標(biāo)準(zhǔn)化：
根據(jù)AACC/AOAC國際膳食纖維測定中α-淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶和蛋白酶的使用歷史，準(zhǔn)確可靠測量所需的活性為：
淀粉葡萄糖苷酶（黑曲霉）；每次檢測0.2毫升。
3300單位/毫升（用還原糖測定可溶性淀粉）或
200單位/毫升（AMG分析試劑；過量β-葡萄糖苷酶存在下的pNP-β-麥芽糖苷）。
耐熱α-淀粉酶（地衣芽孢桿菌）；每次測定0.05毫升。
10000 U/mL（用還原糖測定可溶性淀粉）或3000 U/mL（Ceralpha試劑；在耐熱α-葡萄糖苷酶存在下阻斷對硝基苯基麥芽庚糖苷）。
蛋白酶（地衣芽孢桿菌；枯草桿菌素A）；每次檢測0.10毫升。350酪氨酸單位/mL。（50毫克/毫升；7個酪氨酸單位/毫克）（用酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)品測定酪蛋白）。
另外，蛋白酶可以方便地用偶氮酪蛋白（Megazyme cat）進行檢測。編號S-AZCAS）。
更多詳情：
McCleary，B.V.（1999年）。纖維酶純度和活性測定。谷物食品世界，44（8），590-596。
重要污染活動：
1在淀粉葡萄糖苷酶制劑中：
對用于膳食纖維測定的淀粉葡萄糖苷酶制劑的評價表明，許多制劑（除了純度很高、價格昂貴的制劑外）含有大量的污染β-葡聚糖酶（纖維素酶）。在某些制劑中，這種污染高達1%（以活性計），并導(dǎo)致β-葡聚糖的低估高達10-15%。淀粉葡萄糖苷酶中的纖維素酶污染可以通過以大麥β-葡聚糖為底物的粘度學(xué)研究或通過使用Megazymeβ-葡聚糖酶測試片（用于β-葡聚糖酶和纖維素酶的測量）來最好地證明和估計。
淀粉葡萄糖苷酶的纖維素酶污染對β-葡聚糖粘度（即分子大小）的影響如圖4所示。將大麥β-葡聚糖（10 mL，10 mg/mL）置于醋酸鈉緩沖液（50 mM，pH 4.5）中，在40℃下在C型U形管粘度計中與淀粉葡萄糖苷酶（TDF分析中使用的0.2 mL制劑）一起培養(yǎng)。在不同的時間間隔進行粘度測量，比粘度計算為（t-t）/t，其中t是溶劑的流動時間，t是消化液的流動時間。ooo
比較了兩種酶制劑：
A。Megazyme淀粉葡萄糖苷酶（E-AMGDF）（與用于TDF測定的其他商業(yè)制劑的AMG濃度相同）。
B。另一種市售淀粉葡萄糖苷酶制劑，推薦用于膳食纖維測定。
很明顯，Megazyme淀粉葡萄糖苷酶（E-AMGDF）基本上沒有污染β-葡聚糖酶，而另一種制劑含有大量的這種污染物。
2在蛋白酶制劑中：
蛋白酶被（1,3）（1,4）-β-葡聚糖酶污染的程度可使用淀粉葡萄糖苷酶中纖維素酶的測量程序進行測定，修改后測定pH值為7.5（磷酸鈉緩沖液，50 mM）。
三。在α-淀粉酶制劑中：
耐熱α-淀粉酶無污染酶活性。
圖4。以大麥β-葡聚糖為底物的粘度計測定淀粉葡萄糖苷酶制劑中的纖維素酶污染（參考正文）。
A、 巨酶淀粉葡萄糖苷酶（E-AMGDF）。
B、 另一種用于膳食纖維測定的淀粉葡萄糖苷酶制劑。
膳食纖維是一種復(fù)雜的有機物質(zhì)的混合物，包括親水性化合物，如可溶和不可溶的多糖和不可消化的低聚糖，以及一系列不健康的或多或少疏水性的化合物，如角質(zhì)、樹莓和木脂素。本手冊中概述的總膳食纖維測定程序基于Lee等人的方法。以及Prosky等人。（AOAC 991.43、AOAC 985.29、AACC 32-07.01和AACC 32-05.01）。然而，Megazyme全膳食纖維試劑盒中的酶也可用于其他膳食纖維分析方法，如AACC方法32-21.01和AACC方法32-06.01。12,3
原理（總膳食纖維）：
總膳食纖維（TDF）是在干燥和脫脂（如果脂肪含量大于10%）材料的復(fù)樣上測定的。樣品在~100°C下用熱穩(wěn)定α-淀粉酶煮熟，使淀粉凝膠化、水解和解聚；在60°C下與蛋白酶（溶解和解聚蛋白質(zhì)）和淀粉葡萄糖苷酶（將淀粉碎片水解成葡萄糖）一起培養(yǎng)；用四體積乙醇沉淀可溶性纖維，去除淀粉中解聚的蛋白質(zhì)和葡萄糖。過濾殘留物；用78%乙醇、95%乙醇和丙酮洗滌；干燥；稱重。對一份樣品進行蛋白質(zhì)分析，另一份在525°C下培養(yǎng)以測定灰分。TDF是過濾和干燥殘渣的重量減去蛋白質(zhì)和灰分的重量。
Megazyme-TDF檢測試劑盒的主要優(yōu)點是它含有高純度、無干擾活性的酶，并且酶的活性是標(biāo)準(zhǔn)化的。標(biāo)準(zhǔn)化α-淀粉酶活性在抗性淀粉測定中的重要性已得到公認(rèn)。Megazyme淀粉葡萄糖苷酶基本上不含纖維素酶，而其他常用制劑含有嚴(yán)重的這種活性污染，導(dǎo)致β-葡聚糖的溶解和低估。所有的Megazyme TDF酶都以即用、穩(wěn)定的液態(tài)形式供應(yīng)。
范圍：
適用于谷類、果蔬、谷類水果制品及食品。
酶純度和標(biāo)準(zhǔn)化：
采用AOAC方法985.29和991.43和AACC方法32-05.01中推薦的標(biāo)準(zhǔn)，評估了巨酶α-淀粉酶、蛋白酶和淀粉葡萄糖苷酶的有效性和純度。Megazyme耐熱α-淀粉酶（E-BLAAM）的活性為3000 U/mL（Ceralpha法）；蛋白酶的供應(yīng)濃度為50 mg/mL（~350酪氨酸U/mL）；淀粉葡萄糖苷酶的供應(yīng)濃度為200 U/mL（對硝基苯基β-麥芽糖苷甙底物）（或可溶性淀粉3300 U/mL）。這種淀粉葡萄糖苷酶活性是傳統(tǒng)TDF分析中所用濃度的150%，因此在分析中使用0.2毫升（而不是0.3毫升）。
Megazyme淀粉葡萄糖苷酶（E-AMGDF）基本上不含纖維素酶，而在用于TDF測定的其他制劑中，纖維素酶污染可高達淀粉葡萄糖苷酶的1%（以活性計）。這種程度的污染導(dǎo)致β-葡聚糖的低估率高達10-15%。
巨酵素酶的測量和標(biāo)準(zhǔn)化方法可根據(jù)要求提供。
TDF檢測試劑盒：
Megazyme提供100/200分析試劑盒，其中包含完整的分析方法以及：
100測定試劑盒（cat。不。K-TDFR-100A）
| 瓶子1： | 耐熱α-淀粉酶（10毫升，~3000 U/mL |
| （Ceralpha法）；~10000 U/mL（可溶性） | |
| 淀粉）（Megazyme cat。編號：E-BLAAM）。 | |
| 瓶子2： | 純化蛋白酶（10毫升，50毫克/毫升；約350酪氨酸 |
| U/mL）（Megazyme cat。編號E-BSPRT）。 | |
| 瓶子3： | 純化淀粉葡萄糖苷酶（20ml，3300u/mL |
| 可溶性淀粉）（Megazyme cat。編號：E-AMGDF）。 |
| 瓶子1： | 耐熱α-淀粉酶（20ml，~3000u/mL |
| （Ceralpha法）；~10000 U/mL（可溶性） | |
| 淀粉）（Megazyme cat。編號：E-BLAAM）。 | |
| 瓶子2： | 純化蛋白酶（20毫升，50毫克/毫升；約350酪氨酸 |
| U/mL）（Megazyme cat。編號E-BSPRT）。 |
瓶子3：（x 2）純化淀粉葡萄糖苷酶（20毫升，可溶性淀粉3300 U/mL）（Megazyme cat。編號：E-AMGDF）。
分析級硅藻土，100 g或500 g包裝，可單獨購買（類別。編號G-CEL-100G或cat。編號G-CEL-500G）。®
TDF檢測對照試劑盒（）：K-TDFC公司
該試劑盒與TDF分析試劑盒一起使用，以確定酶的有效性和純度。該試劑盒包含下列每種成分的一小瓶和一份技術(shù)數(shù)據(jù)表（K-TDFC；膳食纖維對照品）。
該試劑盒中包含的每種成分的量足以進行至少10次分析。
| 組件 | 數(shù)量 |
| β-葡聚糖（大麥） | 1克 |
| 高直鏈淀粉 | 10克 |
| 淀粉（小麥） | 10克 |
| 酪蛋白 | 5克 |
| 果膠 | 1克 |
| 落葉松半乳糖 | 1克 |
方法1：
總、可溶性和不溶性膳食纖維的測定
根據(jù)AOAC方法991.43“總、可溶和不溶
《食品中的膳食纖維》（1991年第一次行動）和AACC法
32-07.01“食品和食品中可溶性、不溶性和總膳食纖維的測定”（最終批準(zhǔn)10-16-91）。
定義：
本方法是對AACC總膳食纖維（TDF）法（32-05.01）和AACC可溶性/不溶性膳食纖維法（燕麥制品）32-21.01（見第9頁注1）的簡化修改
1. 簡單地說，1g干燥食品樣品（復(fù)制品）通過熱穩(wěn)定α-淀粉酶、蛋白酶和淀粉葡萄糖苷酶進行連續(xù)酶消化。
2. 過濾不溶性膳食纖維（IDF），然后用溫蒸餾水洗滌殘留物。用4體積95%乙醇（EtOH）沉淀濾液和水洗液的混合液，測定可溶性膳食纖維（SDF）。然后過濾沉淀物并干燥。SDF和IDF殘基均針對蛋白質(zhì)、灰分和空白進行校正，以便最終計算SDF和IDF值。
3. 用EtOH沉淀SDF，然后過濾、干燥和稱重殘留物�？偵攀忱w維（TDF）值根據(jù)蛋白質(zhì)和灰分含量進行校正。
經(jīng)美國谷物化學(xué)家協(xié)會許可再版，美國明尼蘇達州圣保羅市。
范圍：
本方法測定加工食品和原材料（如谷類產(chǎn)品、水果和蔬菜）中的可溶性、不溶性和總膳食纖維含量。
儀器：
1. 400 mL和600 mL高的燒杯。
2. 熔塊坩堝，Gooch，熔塊盤，Pyrex50 mL，孔徑粗，ASTM 40-60µm，康寧諾。32940-50C或同等產(chǎn)品。準(zhǔn)備如下：®®
a、 在525°C下在馬弗爐中過夜。
b、 用真空除去硅藻土和灰燼材料。
c、 室溫下，在2%微量清潔溶液（試劑7，第5頁）中浸泡1h。
d、 用水和去離子水沖洗坩堝。
e、 對于最終沖洗，使用15 mL丙酮并風(fēng)干。
f、 向干燥坩堝中添加約1.0 g硅藻土，并在130°C下干燥至恒重。
g、 在干燥器中冷卻坩堝約1小時，并記錄含有硅藻土的坩堝的重量。
3. 過濾瓶，厚壁，帶1L側(cè)臂。
4. 過濾瓶用橡膠環(huán)適配器。
5. 真空源：真空泵或抽氣器，帶有可調(diào)節(jié)真空的調(diào)節(jié)器。
6. 大容量（20-24升）帶蓋水浴槽；能夠保持100°C的溫度；配有自動定時器，用于開關(guān)操作。
7. 天平，0.1mg精度。
8. 兩個機械對流烘箱，設(shè)置為103±2°C和130±3°C。
9. 定時器。
10. 帶SiO或同等干燥劑的密閉干燥器。干燥劑每兩周在130°C烘箱中干燥一夜。2
11. pH計。
12. 容量為50μL和5μL的移液管。
13. 分配器
a、 對于78%EtOH、95%EtOH和丙酮，15±0.5 mL。
b、 緩沖液40±0.5 mL。
14. 量筒，500毫升。
15. 磁力攪拌器和攪拌棒。
16. 橡膠抹刀。
17. 馬弗爐，525±5°C。
試劑：
1. 乙醇，95%v/v。
2. 乙醇，78%。將821 mL 95%v/v乙醇放入1 L容量瓶中。用去離子水稀釋至一定體積�；旌暇鶆�。檢查液位，如有必要，添加更多去離子水，使其恢復(fù)至1L標(biāo)記。
3. 丙酮，試劑級。
4. TDF分析用酶（巨酵素）。儲存在0-5°C。
a、 α-淀粉酶，熱穩(wěn)定（E-BLAAM）；3000 Ceralpha單位/mL。
b、 蛋白酶（E-BSPRT）；50毫克/毫升；350個酪氨酸單位/毫升。
c、 淀粉葡萄糖苷酶（E-AMGDF）；200 pNPβ-麥芽糖苷單位/mL（或可溶性淀粉3300單位/mL）。
5. 去離子水。
6. Celite，分析級（Megazyme cat。編號G-CELI）。®TE公司
7. 清潔溶液，Micro（國際產(chǎn)品公司，新澤西州特倫頓）。用去離子水配制2%溶液。
8. MES/TRIS緩沖液，每個0.05 M，24°C時pH值8.2。溶解
19.52 g 2（N-嗎啉基）乙磺酸（MES）（Megazyme cat。編號B-MES250）和12.2 g三羥甲基氨基甲烷（tris）（Megazyme cat。1.7升去離子水。用6.0 N NaOH將pH調(diào)至8.2。用水稀釋至2升。重要的是將緩沖液的pH值在20°C時調(diào)整到約8.3，或在27-28°C時調(diào)節(jié)到大約8.1。
9. 鹽酸溶液，0.561 N。將93.5 mL 6 N HCl加入1 L容量瓶中約700 mL水中。用水稀釋至1升。
10. pH標(biāo)準(zhǔn)。pH值為4.0、7.0和10.0的緩沖溶液。
酶純度：
為了確保有適當(dāng)?shù)拿富钚院蜎]有不良的酶活性，在整個程序中運行下列材料。每一批新的酶都要檢測，之前6個月沒有檢測過的酶也要檢測。
或者，酶活性和純度可以通過本手冊第17頁和第18頁總結(jié)的分析程序來確定。
| |
活動 | 樣品重量 | 預(yù)期 |
| 試驗樣品 | 測試 | （克） | 回收率（%） |
| 柑橘果膠 | 果膠酶一 | 0.1 | 90-95c |
| β-葡聚糖（大麥） |
β-葡聚糖酶 （纖維素酶）一 |
0.1 | 95-100 |
| 小麥淀粉 | 淀粉酶b | 1.0 | 0-1 |
| 酪蛋白 | 蛋白酶b | 0.3 | 0-2 |
| 高直鏈淀粉 | 淀粉酶 | 1.0 | ~30個d |
一 該活動不應(yīng)出現(xiàn)在測試中。該活動應(yīng)在測試中完全發(fā)揮作用。由于柑橘果膠的不完全沉淀，其值較低。bc
d這種材料含有高水平的“抗酶”淀粉。準(zhǔn)確的預(yù)期回收值將受到試驗中使用的耐熱α-淀粉酶水平的影響。
程序：
1空白
每次分析時，將兩個空白與樣品一起放在一起，以測量試劑對殘留物的貢獻。
2樣品
a、 準(zhǔn)確稱取復(fù)制的1.000±0.005 g樣品于400 mL高型燒杯中。
b、 向每個燒杯中添加40毫升MES-TRIS混合緩沖溶液（pH值8.2）。在每個燒杯中加入磁力攪拌棒。在磁力攪拌器上攪拌，直到樣品完全分散在溶液中（這可以防止塊狀物的形成，這會使樣品無法被酶吸收）。
三。熱穩(wěn)定淀粉酶孵育α
a、 加入50µL熱穩(wěn)定α-淀粉酶溶液，同時低速攪拌。
b、 在每個燒杯上蓋上鋁箔方塊。
c、 將蓋好的樣品置于98-100°c的振蕩水浴中，持續(xù)攪拌培養(yǎng)30分鐘。一旦所有燒杯都在熱水浴中，開始計時。
4很酷
a、 從熱水浴中取出所有樣品燒杯并冷卻至60°C。
b、 拆下箔蓋。
c、 如有必要，用抹刀刮掉燒杯周圍的任何環(huán)和燒杯底部的凝膠。
d、 用移液管用10毫升蒸餾水沖洗燒杯和抹刀的側(cè)壁。
e、 將熱水從浴槽中排出60°C的熱水。
5蛋白酶孵育
a、 向每個樣品中添加100µL蛋白酶溶液。
b、 重新蓋上鋁箔。
c、 在60±1°c的振蕩水浴中孵育，持續(xù)攪拌30分鐘，水浴溫度達到60°c時開始計時。
6pH值檢查
a、 從振蕩水浴中取出樣品燒杯。
b、 拆下蓋子。
c、 攪拌時，向樣品中加入5ml 0.561N HCl溶液。
d、 檢查pH值，應(yīng)為4.1-4.8。如有必要，可使用額外的5%NaOH溶液或5%HCl溶液調(diào)整pH值（見第10頁注2）。
7淀粉葡萄糖苷酶孵育
a、 在磁力攪拌器上攪拌的同時加入200微升的淀粉葡萄糖苷酶溶液。
b、 更換鋁蓋。
c、 在60°c的振蕩水浴中培養(yǎng)30分鐘，并持續(xù)攪拌。水浴溫度達到60°C時開始計時。
A、 不溶性膳食纖維
8過濾裝置
a、 將含有硅藻土的坩堝去皮，精確至0.1 mg。
b、 使用大約3毫升蒸餾水在坩堝中潤濕和重新分配硅藻土層。
c、 對坩堝施加抽吸，將硅藻土拉到熔塊玻璃上，形成均勻的墊子。
9過濾酶混合物從步驟7通過坩堝進入過濾瓶。
10洗滌殘渣用預(yù)熱到70°C的10毫升蒸餾水兩次。在清洗坩堝中的殘留物之前，用水沖洗燒杯。保存濾液和水洗液以測定SDF。將溶液轉(zhuǎn)移到預(yù)先去皮的600 mL高型燒杯中（對于SDF測定，請參閱第8頁SDF程序的第11步）。
11洗滌殘渣用10毫升：
a、 95%乙醚
b、 丙酮
12干坩堝在103°C烘箱中過夜。
13冷坩堝在干燥器中放置約1小時。稱量含有膳食纖維殘留物和硅藻土的坩堝，精確到最近
0.1毫克。減去皮重，即。
干燥坩堝和硅藻土的重量。
14蛋白質(zhì)和灰分測定。
對每種纖維的一個殘留物進行蛋白質(zhì)分析，并對第二個殘留物進行灰分分析。
a、 用凱氏定氮法對殘留物進行蛋白質(zhì)分析。所有情況下使用6.25因子計算蛋白質(zhì)g。
b、 對于灰分分析，在525°C下將第二個殘渣焚燒5小時。在干燥器中冷卻并稱重，精確至0.1 mg。減去坩堝和硅藻土重量，以確定灰分含量（見第10頁注3）。
B、 可溶性膳食纖維
1-10頁。遵循IDF方法的步驟1-10。1-10頁。遵循IDF方法的步驟1-10。
11稱IDF程序步驟10中預(yù)去皮燒杯中濾液和水洗液的混合溶液。
12SDF沉淀
a、 添加4份預(yù)熱至60°C的95%EtOH。使用一部分EtOH從IDF程序中沖洗過濾瓶（步驟10）。或者，將濾液和水洗液的混合溶液的重量調(diào)整至80 g，并添加320 mL預(yù)熱（60°C）95%EtOH。
b、 讓沉淀在室溫下形成60分鐘。
13過濾裝置
a、 將含有硅藻土的坩堝去皮，精確至0.1 mg。
b、 在坩堝中用15毫升78%乙醇從洗滌瓶中潤濕并重新分配硅藻土層。
c、 對坩堝施加抽吸，將硅藻土拉到熔塊玻璃上，形成均勻的墊子。
14過濾
a、 通過坩堝過濾SDF步驟12中沉淀的酶消化物。
b、 使用含78%乙醚的洗滌瓶和橡膠抹刀，將所有剩余顆粒定量轉(zhuǎn)移到坩堝中。
15洗
使用真空，依次用以下兩份15毫升的溶液清洗殘留物：（見第10頁注4）。
a、 78%環(huán)氧乙烷
b、 95%乙醚
c、 丙酮
16干坩堝在103°C烘箱中過夜。
17繼續(xù)IDF方法的步驟13和14。
C、 總膳食纖維
1-7頁。遵循步驟1-7。1-7頁。遵循步驟1-7。
8用EtOH沉淀膳食纖維。
a、 向每個樣品中加入225毫升95%乙醇，預(yù)熱至60°C。加熱后測量體積。乙醇體積與樣品體積之比應(yīng)為4:1。如果95%的EtOH意外過熱至65°C，則添加228 mL用于擴大酒精體積調(diào)節(jié)。
b、 用大鋁箔覆蓋所有樣品。
c、 讓沉淀在室溫下形成60分鐘。
9繼續(xù)執(zhí)行SDF程序的步驟13-17。
計算：
膳食纖維(%) =
來自：R=m中的殘留物重量1；R=m中的殘留物重量2 m=樣品重量1；m=樣品重量21122 12
A=來自R的灰分重量；p=來自R和12
來自：
BR=空白殘留物；BP=來自BR BA的空白蛋白質(zhì)=BR的空白灰分。12
提示：這些計算可以通過使用Megazyme Mega Calc來簡化，可以從Megazyme網(wǎng)站上的產(chǎn)品下載(www.megazyme.com網(wǎng)站).TM公司
注意：
1. 本方法與AACC方法32-05.01和32-21.01的區(qū)別如下：
a、 使用40 mL MES-TRIS緩沖液，每個0.05 M，24°C時pH值8.2，而不是50 mL磷酸鹽緩沖液，0.08 M，pH 6.0。
MES-TRIS緩沖液的pH值隨溫度變化。
MES-TRIS緩沖液（即24°C時為8.2）的pH值在
85-90°C和7.4-7.6（55-60°C）。注意，熱穩(wěn)定α-淀粉酶的最適pH值從60°C時的pH 6.0移動到90°C時的pH 7.0。
b、 由于此處使用的酶活性更高，使用的耐熱α-淀粉酶的體積已從200µL減少到50µL。
c、 如有必要，刮掉燒杯周圍在熱穩(wěn)定α-淀粉酶培養(yǎng)后留下的任何環(huán)。在熱穩(wěn)定α-淀粉酶孵育后，用移液管加入10ml水沖洗抹刀和燒杯側(cè)壁。
d、 蛋白酶作用不需要調(diào)節(jié)pH值，因此培養(yǎng)液中不添加NaOH。
e、 對于淀粉葡萄糖苷酶的作用，添加5 mL 0.561 N HCl溶液。
f、 對于TDF測定，沉淀步驟中添加的95%EtOH的量為225 mL，而不是280 mL。對于SDF/IDF測定，濾液和洗滌液的重量調(diào)整為80 g，而不是100 g。因此，在60℃下添加320 mL 95%EtOH�；蛘�，稱取濾液和洗滌液的混合液并加入4 vol。95%乙醇。通過此修改，總過濾體積減少到375-400 mL（參見第11頁和第12頁圖1和2）。
2. 由于溶液的pH值在較低溫度下會增加，因此在60°C水浴中放置燒杯直到其準(zhǔn)備好進行pH值調(diào)整。一般情況下，大多數(shù)燕麥、大麥、小麥和玉米制品不需要額外的pH調(diào)節(jié)（用5%的HCl或5%的NaOH）。對于此類已知產(chǎn)品，在向樣品中添加5 mL 0.561 N HCl后，可以跳過pH檢查程序。建議將空白溶液pH值的常規(guī)檢查作為災(zāi)難性檢查。如果空白不在理想的pH值范圍內(nèi)，也應(yīng)檢查樣品。
3. 有一些跡象表明，延遲用95%的EtOH和丙酮清洗IDF殘留物可能會導(dǎo)致IDF值膨脹。因此，建議在SDF/IDF程序結(jié)束時不要沖洗IDF殘留物。
4. 在一些樣品中，會形成樹膠，從而捕獲液體。如果出現(xiàn)這種情況，用抹刀將薄膜層弄碎。
參考文獻：
1. Lee，S.C.，Prosky，L.和DeVries，J.W.（1992年）。食品中總可溶性和不溶性膳食纖維的測定.酶重量法，MES-TRIS緩沖液：協(xié)作研究。J、 助理關(guān)閉。肛門�！痘瘜W(xué)》，75395-416。
2. 普羅斯基，L.，Asp，N.G.，施維澤，T.F.，德弗里斯，J.W.和弗爾達，I.（1988年）。食品和食品中不溶性、可溶性和總膳食纖維的測定：實驗室間研究。J、 助理關(guān)閉。肛門。《化學(xué)》，711017-1023。
3. 普羅斯基，L.，Asp，N.G.，施維澤，T.F.，德弗里斯，J.W.和弗爾達，I.（1992年）。食品和食品中不溶性和可溶性膳食纖維的測定：合作研究。J、 助理關(guān)閉。肛門。
化學(xué)。, 75, 360-367.
圖1。總膳食纖維測定程序的分析方案。
圖2.可溶性和不溶性膳食纖維測定程序的分析方案。
方法2：
總膳食纖維的測定
根據(jù)AACC方法32-05.01和AOAC方法985.29。
儀器：
1. 分配器
a、 對于95%乙醇，280±2.0 mL。
b、 78%乙醇、95%乙醇和丙酮為10±0.5 mL。
c、 緩沖液為50±0.5 mL。
2. 所有其他設(shè)備如本手冊第4頁所述。
試劑：
1. pH值為6.0.08的磷酸鹽緩沖液。將1.400 g無水磷酸二鈉（或1.753 g二水合物）和9.68 g一水磷酸二鈉（NaHPO）（或10.94 g二水合物）溶解在約700 mL蒸餾水中。用水稀釋至1升。用pH計檢查pH值。2424
2. 氫氧化鈉溶液，0.275 N。使用適當(dāng)?shù)奶幚眍A(yù)防措施，將11.00 g ACS級NaOH溶解在約700 mL蒸餾水中，并放入1 L容量瓶中。冷卻并用水稀釋至一定體積。
3. 0.325N鹽酸溶液。在容量瓶中用水將已知滴定度的儲備溶液（即325 mL 1.0 N HCl）稀釋至1 L。
程序：
樣品制備
總膳食纖維應(yīng)以干燥、低脂或無脂樣品為基礎(chǔ)進行測定。使樣品均勻化，并在70°C真空烘箱中干燥過夜。在干燥器中冷卻，重新稱重并記錄干燥過程中的重量損失。將干燥樣品的一部分干燥至0.3-0.5 mm的篩網(wǎng)。如果樣品不能加熱，則在研磨前冷凍干燥。如果高脂肪含量（>10%）妨礙正確研磨，則在研磨前用石油醚脫脂三次，每次25毫升（每克樣品）。分析混合膳食時，在測定總膳食纖維之前，一定要先提取脂肪。記錄因脂肪導(dǎo)致的體重減輕。正確測定去除水分和脂肪的最終膳食纖維百分比。將干燥研磨后的樣品儲存在干燥器中的加蓋罐中，直到分析開始。
方法
在整個過程中使用空白樣品，以測量從試劑到殘留物的任何貢獻。
1. 稱取兩份1g樣品，精確至0.1mg，放入400ml高型燒杯中。樣品重量的差異應(yīng)小于
彼此各20毫克。向每個燒杯中添加50毫升磷酸鹽緩沖液（pH 6.0），并用pH計檢查pH值。如果pH值不等于6.0±0.1，則進行調(diào)整。
2. 加入50µL熱穩(wěn)定α-淀粉酶溶液。
3. 在燒杯上蓋上鋁箔，放入沸水浴中。燒杯必須在98-100°C下培養(yǎng)15分鐘。每隔5分鐘輕輕搖動。
注：當(dāng)槽中燒杯的數(shù)量使燒杯內(nèi)容物難以達到98-100°C的內(nèi)部溫度時，應(yīng)增加培養(yǎng)時間。使用溫度計指示
在98-100°C下達到15分鐘。在沸水浴中總共30分鐘應(yīng)足夠。
4. 室溫下冷卻溶液。
5. 通過添加10 mL 0.275 N NaOH溶液將pH值調(diào)整至7.5±0.1。用pH計檢查pH值。
6. 加入100µL蛋白酶溶液。
7. 用鋁箔蓋住燒杯，在60°C下培養(yǎng)，連續(xù)攪拌30分鐘。
8. 冷卻并添加10 mL 0.325 N HCl溶液，以調(diào)節(jié)pH至
4.5±0.2。用pH計檢查pH值。
9. 加入200µL淀粉葡萄糖苷酶，蓋上鋁箔，在60°C下連續(xù)攪拌培養(yǎng)30分鐘。
10. 添加280毫升95%乙醇，預(yù)熱至60°C（加熱前測量體積）。讓沉淀在室溫下形成
60分鐘。
11. 稱取含有硅藻土的坩堝，精確至0.1 mg，然后使用洗滌瓶中78%的EtOH氣流濕潤并分配坩堝中的硅藻土層。
12. 用吸力將硅藻土拉到燒結(jié)玻璃上，使其成為均勻的墊子。保持吸力，并將沉淀從酶消化液中定量轉(zhuǎn)移到坩堝中。
13. 用三份20ml的
78%乙醇，兩份10毫升95%乙醇和兩份
10毫升丙酮。在某些情況下，可能會形成牙齦
過濾過程中，將液體截留在殘渣中。如果是這樣，用抹刀打破表面薄膜，以提高過濾效果。在整個過濾過程中，小心的間歇抽吸可以避免較長的過濾時間。
14. 在70°C真空烘箱或105°C空氣烘箱中干燥含有殘留物的坩堝過夜。
15. 在干燥器中冷卻并稱重，精確至0.1 mg。減去坩堝和硅藻土的重量，以確定殘留物的重量。
16. 采用AACC方法46-13，以N×6.25為轉(zhuǎn)換因子，分析一組重復(fù)樣品中的蛋白質(zhì)殘留。
17. 在525°C下將第二份殘留物樣品焚燒5 h。在干燥器中冷卻并稱重至0.1 mg。減去坩堝和硅藻土重量以測定灰分。
圖3。總膳食纖維分析方案。
計算：
| 未腐蝕av空白殘留物（UABR）= | 影音留白 |
| 空白（從步驟15開始），mg | |
| 空白蛋白殘基（BPR）= | 空白中UABR x%蛋白質(zhì) |
| （步驟16）/100 | |
| 空白灰渣（BAR）= | UABR x%灰分空白 |
| （步驟17）/100 | |
| 校正空白（CB）= | UABR-BPR-BAR |
| 未腐蝕av樣品殘留量（USAR）= | Av樣品復(fù)本殘留量 |
| 樣品（步驟15）mg | |
| 樣品蛋白質(zhì)殘留（SPR）= | 樣品中的USAR x%蛋白質(zhì) |
| （步驟16）/100 | |
| 樣品灰渣（SAR）= | 樣品中的USAR x%灰分 |
| （步驟17）/100 | |
| 校正樣品殘留量（CSR）= | USAR-SPR-SAR-CB |
| %TDF公司= | 100 x CSR/mg樣品 |
提示：這些計算可以通過使用Megazyme Mega Calc來簡化，可以從Megazyme網(wǎng)站上的產(chǎn)品下載(www.megazyme.com網(wǎng)站). 另請參閱本手冊第9頁。TM公司
參考文獻：
1. 官方分析化學(xué)家協(xié)會。（1985年）。官方分析方法，第14版，補遺1期。秒。43，A14-43，A20，第399頁。
2. 官方分析化學(xué)家協(xié)會（1986年）。方法的改變。J、 助理關(guān)閉。肛門�！痘瘜W(xué)》，69370。
3. 官方分析化學(xué)家協(xié)會（1987年）。方法的改變。J、 助理關(guān)閉。肛門。化學(xué)，70，393。
4. 普羅斯基，L.，Asp，N.G.，弗爾達，I.，德弗里斯，J.W.，施維澤，T.F.和哈蘭，B.F.（1985年）。食品和食品中總膳食纖維的測定：合作研究。J、 助理關(guān)閉。肛門�；瘜W(xué)，68677。
5. 普羅斯基，L.，Asp，N.G.，施維澤，T.F.，德弗里斯，J.W.和弗爾達，I.（1988年）。食品和食品中不溶性、可溶性和總膳食纖維的測定。J、 助理關(guān)閉。肛門�！痘瘜W(xué)》，711017。
活性和純度的測量
用于總膳食纖維測量的酶
為了成功應(yīng)用AACC/AOAC國際膳食纖維分析程序，所用的酶必須具有所需的活性，并且沒有重要的污染活性。迄今為止遇到的一些問題包括：
a、 纖維素酶、木聚糖酶和果膠酶污染淀粉葡萄糖苷酶（導(dǎo)致β-葡聚糖、阿拉伯木聚糖和果膠降解和低估）。
b、 不同濃度的耐熱α-淀粉酶（影響抗性淀粉的測量）（見參考文獻1）。
c、 蛋白酶受到1,3:1,4-β-葡聚糖酶的污染（導(dǎo)致對β-葡聚糖的低估）。
所需活動的標(biāo)準(zhǔn)化：
根據(jù)AACC/AOAC國際膳食纖維測定中α-淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶和蛋白酶的使用歷史，準(zhǔn)確可靠測量所需的活性為：
淀粉葡萄糖苷酶（黑曲霉）；每次檢測0.2毫升。
3300單位/毫升（用還原糖測定可溶性淀粉）或
200單位/毫升（AMG分析試劑；過量β-葡萄糖苷酶存在下的pNP-β-麥芽糖苷）。
耐熱α-淀粉酶（地衣芽孢桿菌）；每次測定0.05毫升。
10000 U/mL（用還原糖測定可溶性淀粉）或3000 U/mL（Ceralpha試劑；在耐熱α-葡萄糖苷酶存在下阻斷對硝基苯基麥芽庚糖苷）。
蛋白酶（地衣芽孢桿菌；枯草桿菌素A）；每次檢測0.10毫升。350酪氨酸單位/mL。（50毫克/毫升；7個酪氨酸單位/毫克）（用酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)品測定酪蛋白）。
另外，蛋白酶可以方便地用偶氮酪蛋白（Megazyme cat）進行檢測。編號S-AZCAS）。
更多詳情：
McCleary，B.V.（1999年）。纖維酶純度和活性測定。谷物食品世界，44（8），590-596。
重要污染活動：
1在淀粉葡萄糖苷酶制劑中：
對用于膳食纖維測定的淀粉葡萄糖苷酶制劑的評價表明，許多制劑（除了純度很高、價格昂貴的制劑外）含有大量的污染β-葡聚糖酶（纖維素酶）。在某些制劑中，這種污染高達1%（以活性計），并導(dǎo)致β-葡聚糖的低估高達10-15%。淀粉葡萄糖苷酶中的纖維素酶污染可以通過以大麥β-葡聚糖為底物的粘度學(xué)研究或通過使用Megazymeβ-葡聚糖酶測試片（用于β-葡聚糖酶和纖維素酶的測量）來最好地證明和估計。
淀粉葡萄糖苷酶的纖維素酶污染對β-葡聚糖粘度（即分子大小）的影響如圖4所示。將大麥β-葡聚糖（10 mL，10 mg/mL）置于醋酸鈉緩沖液（50 mM，pH 4.5）中，在40℃下在C型U形管粘度計中與淀粉葡萄糖苷酶（TDF分析中使用的0.2 mL制劑）一起培養(yǎng)。在不同的時間間隔進行粘度測量，比粘度計算為（t-t）/t，其中t是溶劑的流動時間，t是消化液的流動時間。ooo
比較了兩種酶制劑：
A。Megazyme淀粉葡萄糖苷酶（E-AMGDF）（與用于TDF測定的其他商業(yè)制劑的AMG濃度相同）。
B。另一種市售淀粉葡萄糖苷酶制劑，推薦用于膳食纖維測定。
很明顯，Megazyme淀粉葡萄糖苷酶（E-AMGDF）基本上沒有污染β-葡聚糖酶，而另一種制劑含有大量的這種污染物。
2在蛋白酶制劑中：
蛋白酶被（1,3）（1,4）-β-葡聚糖酶污染的程度可使用淀粉葡萄糖苷酶中纖維素酶的測量程序進行測定，修改后測定pH值為7.5（磷酸鈉緩沖液，50 mM）。
三。在α-淀粉酶制劑中：
耐熱α-淀粉酶無污染酶活性。
圖4。以大麥β-葡聚糖為底物的粘度計測定淀粉葡萄糖苷酶制劑中的纖維素酶污染（參考正文）。
A、 巨酶淀粉葡萄糖苷酶（E-AMGDF）。
B、 另一種用于膳食纖維測定的淀粉葡萄糖苷酶制劑。
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