上游細胞培養(yǎng)是生物制藥生產中的關鍵步驟，對最終產品的質量和產量有著直接影響，是生產高質量生物藥物的關鍵步驟之一。旨在提高生產效率、降低成本并確保生物藥物質量的一致性，隨著生物技術的發(fā)展和市場對高效、可持續(xù)生產的需求增加，工藝開發(fā)與優(yōu)化變得尤為重要。
 
 細胞培養(yǎng)是生物醫(yī)藥領域中一項重要的技術，涉及細胞培養(yǎng)基的選擇、細胞適應、細胞增殖、細胞分化、細胞衰老和細胞死亡等過程。以下是一些關于工藝開發(fā)及優(yōu)化-細胞培養(yǎng)的建議：
  細胞株的選擇是上游細胞培養(yǎng)工藝開發(fā)的首要步驟。通過篩選和優(yōu)化細胞株，可以提高生產效率、降低生產成本并確保產品的一致性。選擇具有高表達能力和穩(wěn)定遺傳特性的細胞株是關鍵的決策。
 
1.2 培養(yǎng)基優(yōu)化
培養(yǎng)基的成分和配方對細胞生長和產物表達有著直接的影響。通過系統(tǒng)的培養(yǎng)基優(yōu)化，可以調節(jié)營養(yǎng)物質濃度、添加生長因子和調控pH值，從而提高培養(yǎng)效率和產物質量。
 
1.3 發(fā)酵過程優(yōu)化
發(fā)酵過程是上游細胞培養(yǎng)的核心環(huán)節(jié)，其操作條件直接關系到細胞生長和產物表達。工藝條件包括溫度、濕度、氧氣濃度、二氧化碳濃度等。這些條件對細胞生長和產物表達有重要影響，可以通過實驗確定最佳的工藝條件，以保證細胞的正常生長和產物的穩(wěn)定表達；實時監(jiān)測關鍵參數(shù)：通過觀察細胞形態(tài)、測定細胞數(shù)量、檢測細胞分泌的生物活性物質等方法，監(jiān)控細胞的生長和分化情況，采取及時的反饋控制，可以保持培養(yǎng)過程的穩(wěn)定性。
 
1.4 探索新的培養(yǎng)方法
不斷探索新的培養(yǎng)方法和技術，如微載體培養(yǎng)、三維培養(yǎng)、低溫培養(yǎng)等，以提高細胞的生長效率、分化能力和實驗結果的可靠性。
 
1.5 質量檢測和控制
在生產過程中進行嚴格的質量檢測和控制，包括細胞狀態(tài)檢測、產物表達量檢測、培養(yǎng)基成分檢測等，以確保產品的質量和穩(wěn)定性。
 
總之，上游細胞培養(yǎng)工藝開發(fā)需要從多個方面進行優(yōu)化和改進，包括細胞系選擇、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基成分、傳代和擴增方法、監(jiān)控方法、質量控制體系以及新的培養(yǎng)方法和技術等。通過不斷優(yōu)化和改進，可以提高細胞的生長效率、分化能力和實驗結果的可靠性。
 
細胞培養(yǎng)的優(yōu)化對于生物制藥工業(yè)而言至關重要，而發(fā)酵過程作為上游細胞培養(yǎng)的核心，其操作條件對細胞生長和產物表達有著直接且關鍵的影響。以下是針對發(fā)酵過程優(yōu)化的幾個關鍵方面的詳細展開：
 
2.1 溫度的精準控制
在細胞培養(yǎng)中，溫度是細胞生長和代謝的重要因素之一。在實際應用中，采用先進的發(fā)酵罐控制系統(tǒng)，首先選擇高精度的溫度傳感器，再通過PID（比例-積分-微分）控制算法調整加熱和冷卻設備，以維持目標溫度。例如，對CHO細胞的培養(yǎng)，可以在不同生長階段調整最適溫度，例如在細胞擴增階段提高至37攝氏度，而在表達階段降至33攝氏度。這樣的溫度調控能夠更好地滿足細胞在不同生長階段的需求，提高生產效率。
 
2.2 氣體流速和混合度的優(yōu)化
控制系統(tǒng)實時監(jiān)測數(shù)據(jù)，建立反饋控制系統(tǒng)，使攪拌速度和氣體進氣速率能夠根據(jù)需要進行即時調整；以及安裝高精度的電極，實時監(jiān)測罐內氧氣和二氧化碳濃度，以指導混合度和氣液傳質的調整。例如，增加攪拌速度可改善混合度，而調整氣體進氣速率則影響氣液傳質效率。在真實生產中，通過這樣的模擬和實驗相結合，能夠更好地指導操作參數(shù)的選擇，以達到最佳的氣液傳質效果。
 
2.3 溶氧控制與傳質的平衡
通過在線溶氧傳感器實時監(jiān)測溶氧水平，并結合反饋控制系統(tǒng)調整攪拌速度和氣體流速。例如，在細胞密度較高的情況下，可以增加氣體流速，提高溶氧水平。這樣的溶氧控制不僅有助于防止細胞窒息，還能夠促進細胞的正常代謝，提高產物表達。
 
2.4 pH值的精準調控
在工藝實踐中，采用酸堿控制系統(tǒng)，結合定期自動添加酸堿溶液的方式，以確保發(fā)酵罐內pH值穩(wěn)定在目標范圍。例如，CHO細胞培養(yǎng)中，通過添加緩沖溶液，可以防止pH值的劇烈波動。通過定期的pH監(jiān)測和調整，維持發(fā)酵環(huán)境的穩(wěn)定，有助于確保細胞在適宜的酸堿條件下生長，保證產物的質量。
 
2.5 傳感技術在優(yōu)化中的應用
在實際生產中，使用高精度的在線傳感器，例如光學溶氧傳感器和pH傳感器，以實時監(jiān)測關鍵參數(shù)，并進行數(shù)據(jù)記錄，以便后續(xù)分析和優(yōu)化。通過這些傳感器，可以及時發(fā)現(xiàn)并糾正異常情況，確保操作條件的穩(wěn)定性。例如，在一個具體的案例中，通過引入高精度的溶氧傳感器，成功減少了培養(yǎng)基中氧氣濃度的不均勻性，進而提高了細胞的生長速率和產物表達水平。
 
2.6 智能化和數(shù)據(jù)分析的整合
建立實時和歷史數(shù)據(jù)分析，用于預測工藝中的變化趨勢，并提供實時建議或監(jiān)測任何潛在問題。結合智能模型和實時數(shù)據(jù)進行對比分析結果，持續(xù)優(yōu)化過程中的控制策略，確保高效、穩(wěn)定和一致性。
 
通過對這些關鍵方面的詳細展開，可以更全面地理解發(fā)酵過程的優(yōu)化策略，為實際生產中的細胞培養(yǎng)工藝提供指導和啟示。這種深度的探討不僅有助于解決當前生產中的挑戰(zhàn)，也為未來細胞培養(yǎng)工藝的進一步創(chuàng)新提供了方向。
   
工藝放大的目標以及策略是在規(guī)模逐漸擴大的情況下，保證細胞在穩(wěn)定的環(huán)境中生長并且進行產物的表達�？剂堪�括細胞密度、生長速率、活率、產物表達量和糖基化水平等等因素。在工藝的放大過程中關鍵控制參數(shù)會分為兩種類型：一種是過程參數(shù)，例如溫度、DO和pH、營養(yǎng)成分、代謝產物、滲透壓等。另一種是受體積和幾何尺寸影響，例如P/V、剪切力、KLa等。通常考量以下幾點因素：
    3.1 攪拌軸功率P計算
攪拌軸功率 P 與反應器直徑D ，攪拌軸直徑d，液柱高度H 。攪拌槳速度n，液體粘度μ,流體密度ρ,重量加速度g以及攪拌器的形式和反應器的結構等有關。
 

對于牛頓型流體，通過因次分析和實驗研究可以得到如下關聯(lián)式：
 其中Np為攪拌軸公里特征常數(shù)；
ReM 攪拌雷諾系數(shù)，F(xiàn)r為攪拌弗魯特數(shù)，K和攪拌器的型式和反應器的幾何尺寸有關的常數(shù)。
 
3.2 恒定功率輸出
P/V和攪拌功率（Np，Power Number）、罐體直徑、攪拌槳直徑、工作體積、液體密度等很多因素有關，一定程度上體現(xiàn)了混合程度，影響培養(yǎng)體系的混合和傳質。因此恒定P/V被推薦為很多工藝放大的準則，是當前最常采用的放大策略�？紤]到細胞剪切力的耐受性不同，常見的P/V范圍在10-40 W/m³。
 
3.3 攪拌恒定等體積功率放大
以單位體積培養(yǎng)液所消耗的攪拌功率相等為基準進行放大，在幾何尺寸相似的情況下：
 
根據(jù)小罐的參數(shù)可計算的大罐攪拌轉速，該轉速還需結合其他參數(shù)，如線速度和KLa ，以及實驗經驗綜合衡量后作出一定調整。
 
3.4 恒定葉端速度（Tip Speed）
培養(yǎng)工藝中，攪拌槳剪切力是需要考慮的重要因素之一。 建議哺乳動物細胞的最大耐受流體速度，在玻璃罐和不銹鋼攪拌生物反應器中培養(yǎng)哺乳動物細胞的典型范圍為1-2m/s，通常，當增加到更大的生物反應器規(guī)模時，基于恒定葉端速度的放大會減少特定功率輸入。
 
對于攪拌槳葉端的剪切力，一般可通過Tip Speed (m/s)=π xd xn 來表示，以及積分剪切因子；
恒定混勻時間是比較簡單的一個放大準則，也可以作為放大的依據(jù)。但在小規(guī)模培養(yǎng)中（3L以下）體積可以很快達到混勻時間，而更大的體積則需要更高的葉端速度才能達到混勻。這就會導致剪切力的提高，造成細胞的損傷。
 
3.5 恒定KLa
KLa是氧氣從氣相進入到液相的速率。反應器中工藝放大的關鍵，O₂作為細胞的重要營養(yǎng)物質，影響細胞的生長及代謝。恒定的KLa放大準則給細胞提供了相同的氧傳遞環(huán)境。但KLa的測定受很多因素影響。比如培養(yǎng)過程中攪拌速度、通氣量等等，在實際操作過程中，KLa隨著工作體積的增加而增加。當達到一定體積后，KLa CO₂又會和KLa相互影響，提高了KLa恒定放大難度，我們需要很多測試方法和分析來確定合適的KLa。
 

氧傳遞系數(shù)KLa的測定：
• 測定培養(yǎng)基：0.1% (w/w) F68 + 6 g/L NaCl in DI water at 37℃
• 過程參數(shù)：Agitator 攪拌轉速、Sparge空氣分布管孔徑、Vw裝液量、Gas Flow
• 測定過程：
1. 空氣平衡培養(yǎng)基，DO電極100%標定；
2. 設定測定Agitation和Sparge rate；
3. 通入氮氣降低DO至小于5 %；
4. 通入空氣直至DO升高至高于95 %；
5. 重復上述步驟測定其他條件下的KLa值；
6. 計算KLa值，dDO/dt= KLa (DOt-Dot-1 )Sparge
 
除此以外，還有很多的因素會影響，一定的放大規(guī)模后還需要考慮pCO₂對細胞生長和蛋白表達的負面影響。小體積培養(yǎng)時主要是由于通入的氣體在上升過程中可以帶走大部分細胞代謝產生的CO₂，基本不用考慮CO₂去除。反而大體積培養(yǎng)中，CO₂會隨著反應器規(guī)模的擴大而降低去除能力。液體的氣體飽和度和氣泡量直接影響CO₂去除，可以提高通氣量并減少氣泡停留時間可以加快移除。

   
本次實驗使用CHO-K1 細胞，細胞根據(jù)標準方法從凍存管中復蘇，然后每三到四天在搖瓶中進行傳代擴增。待細胞量足夠后，將細胞接入CytoLinX WB^®及CytoLinX^® BR-200生物反應器繼續(xù)培養(yǎng)：
 



4.2 細胞培養(yǎng)生長曲線和生化數(shù)據(jù)如圖：
 
 
CytoLinX^® BR 一次性罐體式生物反應器在細胞培養(yǎng)過程中表現(xiàn)出極佳的工藝參數(shù)的控制效果：
 CytoLinX^® 系列生物反應器 ，在細胞培養(yǎng)方面表現(xiàn)出極佳的工藝參數(shù)穩(wěn)定控制的效果 ，為重組蛋白及抗體的生產 、放大及提供了一個可靠的 、高效的解決方案。
 

• 靈活性強，適配度高，更多選擇讓工藝開發(fā)和表征更加靈活；
• 關鍵工藝參數(shù)，如溫度，pH，DO 等數(shù)據(jù)實時反饋以及穩(wěn)定控制；
• 大泡，微泡均可選擇，滿足多種工藝需求。

   

 

• 智能PID參數(shù)，實時監(jiān)控且穩(wěn)定控制培養(yǎng)參數(shù)；
• 設備配件均采用進口品牌，結合自動化軟件，高精度反饋控制；
• 具有專利的底通設計，能夠靈活組合微泡、中泡、大泡設計，優(yōu)化工藝、提高效率且穩(wěn)定。

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