mRNA作為疫苗，可被廣泛應(yīng)用于傳染病、腫瘤以及蛋白替換療法等領(lǐng)域。
1）傳染病領(lǐng)域。mRNA疫苗能夠靶定病毒的保守區(qū)域，直接在細(xì)胞中表達(dá)特定抗原，激活機(jī)體的免疫應(yīng)答產(chǎn)生抗體，從而達(dá)到預(yù)防傳染性疾病的目的；
2）抗腫瘤領(lǐng)域�？鼓[瘤mRNA疫苗根據(jù)作用機(jī)理一般分為兩類(lèi)，基于樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）給藥的mRNA疫苗和直接注射的mRNA疫苗；
3）蛋白替代療法領(lǐng)域。通過(guò)將人體變成自身蛋白加工廠，從而治療一些罕見(jiàn)病。

實(shí)際上，早在COVID-19大流行之前，mRNA疫苗就以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)吸引了大量制藥公司參與研發(fā)。而如今，mRNA疫苗在新冠領(lǐng)域的成功極大地刺激和推動(dòng)了mRNA技術(shù)的發(fā)展和擴(kuò)張。

迄今為止，mRNA藥物生產(chǎn)全過(guò)程均較少公開(kāi)，mRNA原料藥生產(chǎn)平臺(tái)的設(shè)計(jì)分為2個(gè)關(guān)鍵開(kāi)發(fā)領(lǐng)域，上游酶法工藝和下游色譜和超濾純化；純化的mRNA被包封成脂質(zhì)納米顆粒（LNP）得到最終制劑。mRNA構(gòu)建體旨在整合許多有助于降低非特異性免疫激活和提高翻譯效率的因子。為了降低先天免疫系統(tǒng)的激活，該方法整合了N1-甲基假尿苷修飾核苷；為了提高可翻譯性，質(zhì)粒被設(shè)計(jì)為編碼目標(biāo)編碼序列含5和3'未翻譯區(qū)域（UTR）和整個(gè)Poly（A）尾巴，確保是在人類(lèi)細(xì)胞翻譯的最佳尾長(zhǎng)。
新冠病毒的抗原為S蛋白，需要設(shè)計(jì)與構(gòu)建含有S蛋白基因序列的載體，然后通過(guò)大腸桿菌放大培養(yǎng)，獲得大量的攜帶S蛋白基因序列的質(zhì)粒。
質(zhì)粒生產(chǎn)是mRNA疫苗生產(chǎn)的重要一步，早在2020年時(shí)，為滿足這一需求，由迪必爾生物從事十多年原核發(fā)酵從研發(fā)、中試、大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)全過(guò)程發(fā)酵工作經(jīng)驗(yàn)的應(yīng)用支持專家，結(jié)合質(zhì)粒發(fā)酵特點(diǎn)，自身實(shí)驗(yàn)過(guò)程情況，給出質(zhì)粒開(kāi)發(fā)思路的系統(tǒng)性并具有實(shí)驗(yàn)可行性的參考方案，為質(zhì)粒開(kāi)發(fā)人員撰寫(xiě)IND申報(bào)研究方案與研發(fā)報(bào)告提供參考模板。  

發(fā)酵實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)介：質(zhì)粒小試工藝研發(fā)工作需由專業(yè)研發(fā)人員完成。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程遵循GLP的基本原則�？傮w思路，參照中國(guó)藥典與相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)質(zhì)粒生產(chǎn)進(jìn)行小試開(kāi)發(fā)工作，在1.3 L平行反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)優(yōu)化，通過(guò)平行反應(yīng)器篩選，改善產(chǎn)品質(zhì)量并對(duì)每個(gè)質(zhì)粒生產(chǎn)進(jìn)行工藝參數(shù)確認(rèn)，進(jìn)而獲得可用于中試生產(chǎn)的小試培養(yǎng)工藝。
發(fā)酵實(shí)驗(yàn)原理：應(yīng)用大腸桿菌的生長(zhǎng)規(guī)律與代謝途徑，使外源基因質(zhì)粒在大腸桿菌中擴(kuò)增。利用質(zhì)粒DNA分子可以持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外的游離狀態(tài)，隨著染色體復(fù)制而復(fù)制，并通過(guò)細(xì)胞分裂傳遞到后代的規(guī)律，對(duì)大腸桿菌進(jìn)行培養(yǎng)，使重組質(zhì)粒在大腸桿菌中表達(dá)。通過(guò)平行生物反應(yīng)器工藝優(yōu)化來(lái)控制微生物的生長(zhǎng)速率，來(lái)提高質(zhì)粒分離與結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，以提高質(zhì)粒的表達(dá)量。

發(fā)酵實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/strong>通過(guò)1.3 L平行反應(yīng)器培養(yǎng)，對(duì)每個(gè)質(zhì)粒生產(chǎn)進(jìn)行工藝參數(shù)摸索與確認(rèn)，同時(shí)可以獲得用于中試放大生產(chǎn)的質(zhì)粒小試培養(yǎng)工藝。

1.3L*8 Minibox 平行生物反應(yīng)器

實(shí)驗(yàn)方法與步驟：凍存菌解融后按1:1000比例接種種子液，種子液長(zhǎng)好后按照2:100比例移入滅菌好的裝有600ml改良LB培養(yǎng)基的反應(yīng)罐內(nèi)。初始溫度37.0±1.0℃、控制pH 6.9±0.2，溶氧關(guān)聯(lián)攪拌、補(bǔ)料。
 

1

跳過(guò)搖瓶采用1.3 L*8聯(lián)平行生物反應(yīng)器培養(yǎng)，通過(guò)DOE實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用指數(shù)補(bǔ)料策略，可以實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵，增加質(zhì)粒DNA的穩(wěn)定性，提高質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量，是搖瓶的50倍以上。取樣檢測(cè)質(zhì)粒表達(dá)水平，每1小時(shí)取樣測(cè)量一次OD600值，記錄下時(shí)間、溫度、pH、轉(zhuǎn)速、溶氧、OD600值，補(bǔ)料流速等數(shù)據(jù)。OD600值達(dá)到20以上每個(gè)取樣點(diǎn)抽測(cè)質(zhì)粒含量。

1.3L*8 Minibox 平行生物反應(yīng)器

2

通風(fēng)和攪拌的目的是為了提供菌株生長(zhǎng)和代謝所需的氧，大腸桿菌培養(yǎng)在指數(shù)生長(zhǎng)期對(duì)氧的需求量很大，因此及時(shí)有效的調(diào)節(jié)生物反應(yīng)器通氣和攪拌可影響發(fā)酵周期的長(zhǎng)短和代謝產(chǎn)物生成的高低，足夠的溶氧是實(shí)現(xiàn)大腸桿菌高密度發(fā)酵的關(guān)鍵因素之一。

1.3L*8 Minibox 平行生物反應(yīng)器OD600與質(zhì)粒數(shù)增長(zhǎng)趨勢(shì)

可靠有效而經(jīng)濟(jì)的供氧是極為重要的，控制系統(tǒng)可以改變氣體組成中的氧含量，從DO變化情況可以實(shí)時(shí)了解氧的供需規(guī)律及其對(duì)生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成的影響。初始底物消耗完后開(kāi)始補(bǔ)加甘油溶液/優(yōu)化復(fù)合補(bǔ)料溶液，生長(zhǎng)停止結(jié)束發(fā)酵。

3

 

放罐后于4℃環(huán)境，4000rpm離心20min，收集離心杯中的菌體，棄上清。進(jìn)行各發(fā)酵數(shù)據(jù)對(duì)比、工藝重現(xiàn)即可完成上游小試工藝確認(rèn)。

根據(jù)1.3L反應(yīng)器規(guī)模工藝優(yōu)化，對(duì)申報(bào)確定菌種進(jìn)行工藝確認(rèn)，本階段為一系列實(shí)驗(yàn)后的工藝總結(jié)，一般使用WCB菌種及階段報(bào)告確定的工藝來(lái)完成小試工藝的確定。確定反應(yīng)器參數(shù)以及補(bǔ)料策略等關(guān)鍵控制參數(shù)。

質(zhì)粒DNA的規(guī)�；�生產(chǎn)通常是在高密度發(fā)酵情況下進(jìn)行的，通過(guò)小試規(guī)模得到菌種發(fā)酵的基本信息和優(yōu)化條件后，進(jìn)行規(guī)模的放大。對(duì)于臨床I期的生產(chǎn)，采用了GMP放大方法，典型的I期生物工藝為1.3L至200L，下游處理規(guī)模為2L至10L。通過(guò)該開(kāi)發(fā)工藝生產(chǎn)的產(chǎn)品，在生產(chǎn)環(huán)境中執(zhí)行GMP并在符合GMP的條件下轉(zhuǎn)入生產(chǎn)時(shí)，均符合穩(wěn)定性測(cè)試的驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)。

GMP 質(zhì)粒生產(chǎn)   200 L 不銹鋼生物反應(yīng)器

 

2022年4月29日，斯微生物發(fā)布公告，宣布其自主研發(fā)迭代的新冠病毒mRNA疫苗獲得國(guó)家藥監(jiān)局批準(zhǔn)，將開(kāi)展臨床試驗(yàn)。（https://m.gmw.cn/baijia/2022-05/04/35708026.html）
祝賀迪必爾合作伙伴斯微生物新冠疫苗再次獲得我國(guó)臨床批件！

上海企業(yè)自主研發(fā)的新冠mRNA疫苗獲批開(kāi)展臨床試驗(yàn)

 

大疫三年,新冠病毒不斷變異，疫情持續(xù)反復(fù)，國(guó)內(nèi)mRNA新冠疫苗研發(fā)企業(yè)們?nèi)找箠^戰(zhàn)，近期疫情下的上海等城市的生物公司研發(fā)人員們平均閉環(huán)生產(chǎn)（吃住都在工廠）達(dá)50天以上；所面對(duì)的困難挑戰(zhàn)可想而知，不光生活上的，還有實(shí)驗(yàn)開(kāi)展供應(yīng)鏈上的挑戰(zhàn)。我們作為鏈條上的一環(huán)，雖然能解決的問(wèn)題與價(jià)值不一樣，但目的大家應(yīng)該是一致的：研發(fā)出對(duì)抗原始株和變異毒株更有效的新冠疫苗從而終結(jié)這場(chǎng)讓百姓苦不堪言的疫情！

迪必爾生物   松江工廠   奉賢工廠  閉環(huán)生產(chǎn)的同事們

參考文獻(xiàn)：
1.    Whitley,Jill et al. “Development of mRNA manufacturing for vaccines and therapeutics:mRNA platform requirements and development of a scalable production process tosupport early phase clinical trials.” Translational research : the journal oflaboratory and clinical medicine vol. 242 (2022): 38-55.doi:10.1016/j.trsl.2021.11.009