Pipetty 電動移液器雞腸炎沙門氏菌檢測中的應(yīng)用
方案摘要：本方案基于GB/T 40049-2021檢測技術(shù)要求，深度融合Pipetty電動移液器的高精度、防污染、智能便捷等優(yōu)勢，針對雞腸炎沙門氏菌PCR檢測的關(guān)鍵環(huán)節(jié)進行優(yōu)化，顯著提升檢測結(jié)果的重復(fù)性、準確性及實驗效率，適用于實驗室規(guī)�；觇b定場景。
方案詳情：
一、實驗原理
該檢測基于核酸特異性擴增原理，核心是靶向沙門氏菌保守基因（如 invA、fimY）設(shè)計特異性引物。首先提取雞組織、糞便或飼料樣本中的細菌基因組 DNA，隨后在 PCR 反應(yīng)體系中，通過變性、退火、延伸的循環(huán)反應(yīng)，使靶基因片段呈指數(shù)級擴增。最終通過凝膠電泳或熒光定量技術(shù)檢測擴增產(chǎn)物，若出現(xiàn)特異性條帶或熒光信號，則判定樣本中存在雞腸炎沙門氏菌，具有快速、特異、靈敏的優(yōu)勢，適用于批量樣本的快速篩查。
二、實驗準備
1、試劑和材料
除另有規(guī)定外,所用試劑均為分析純。實驗用水均符合GB/T6682-2008二級水規(guī)定LB液體培養(yǎng)基。
① 緩沖蛋白胨水(BPW)前增菌液；
② 亞硒酸鹽胱氨酸(SC)增菌液；
③ 四硫磺酸鹽煌綠(TTB)增菌液；
④ 木糖賴氨酸脫氧膽鹽(XLD)瓊脂 ；
⑤ TAE電泳緩沖液；
⑥ 陽性、陰性對照:陽性對照為腸炎沙門氏菌標準株(CVCC3377)培養(yǎng)液,雞白痢沙門氏；菌標準株(CVCC535)培養(yǎng)液;陰性對照為滅菌超純水；
⑦ 細菌基因組 DNA 提取試劑盒:商品化試劑盒；
⑧ 無水乙醇:-20 ℃預(yù)冷；
⑨ 75% 乙醇:無水乙醇和雙蒸水配制,-20 ℃預(yù)冷；
⑩ DNA 分子量標記:DNA Marker 2000；
⑪ 瓊脂糖；
⑫ 七個持家基因片段的 PCR 引物序列；
⑬ 2×PCR Mix。
2、儀器和設(shè)備
① Pipetty Pro電動移液器，MSIC01-03-20、MSIC01-03-250、MSIC01-03-1000；
② 恒溫培養(yǎng)箱(溫度范圍:5 ℃ ~ 50 ℃,溫度均勻度:≤ ±1 ℃)；
③ 高壓滅菌鍋(滅菌溫度:105 ℃~ 135 ℃,工作壓力:< 0.35 MPa)；
④ 電子天平(感量 0.001 g)；
⑤ 高速離心機(可控溫至4℃、離心速度可達 12000 r/min 以上)；
⑥ 二級生物安全柜；
⑦ 4 ℃冰箱(溫控范圍2℃~8℃);-20℃冰箱；
⑧ PCR 儀；
⑨ 電泳儀(電壓 90 V~ 120 V)；
⑩ 電泳儀(電壓 90 V~ 120 V）；
⑪ 控溫搖床(溫度范圍:5 ℃~50 ℃,振蕩頻率:30 r/min ~ 300 r/min)；
⑫ 凝膠成像儀；
⑬ PCR 反應(yīng)管；
⑭ 1.5 mL帶蓋離心管。
三、實驗步驟
1、將初步鑒定為沙門氏菌的菌株用商品化試劑盒進行基因組 DNA 提取。提取方法按試劑盒說明書要求進行。
2、設(shè)計合成七個持家基因的引物。引物DNA 列參見 B.1。
3、用 B.1中所列七對引物對樣品基因組 DNA 的七個持家基因分別進行 PCR 擴增。使用Pipetty電動移液器，連續(xù)分液模式，設(shè)置單次分液體積25μl，完成96孔板的預(yù)混液分裝，更換吸頭，再將引物、模板、無菌水等依次加入。
4、PCR反應(yīng)程序:94 ℃5 min;94 ℃ 45 s,55 ℃ 45 s,72 ℃1 min,共 35 個循環(huán);72 ℃7 min;4 ℃保存。
5、使用Pipetty電動移液器，取5μL~ 10 μL PCR 產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳,電泳結(jié)束后,用凝膠成像儀觀察結(jié)果。
6、將七個持家基因均擴增出特異性條帶的PCR產(chǎn)物進行測序。
四、結(jié)果判定
1、利用 B.1 規(guī)定的七對引物,陽性對照菌株 PCR 產(chǎn)物電泳后分別出現(xiàn)七條特異性的擴增條帶,陰性對照 PCR 產(chǎn)物無擴增條帶,試驗結(jié)果成立。否則試驗不成立。七個持家基因的 PCR 產(chǎn)物電泳圖參見圖C1。
2、 使用 DNA 序列分析軟件,將七個持家基因 PCR產(chǎn)物 DNA序列與參考序列分別進行一對一比對。
3、七個基因的測序結(jié)果與所對應(yīng)的參考序列均完全一致，則判斷樣品為腸炎沙門氏菌陽性
方案詳情：
一、實驗原理
該檢測基于核酸特異性擴增原理，核心是靶向沙門氏菌保守基因（如 invA、fimY）設(shè)計特異性引物。首先提取雞組織、糞便或飼料樣本中的細菌基因組 DNA，隨后在 PCR 反應(yīng)體系中，通過變性、退火、延伸的循環(huán)反應(yīng)，使靶基因片段呈指數(shù)級擴增。最終通過凝膠電泳或熒光定量技術(shù)檢測擴增產(chǎn)物，若出現(xiàn)特異性條帶或熒光信號，則判定樣本中存在雞腸炎沙門氏菌，具有快速、特異、靈敏的優(yōu)勢，適用于批量樣本的快速篩查。
二、實驗準備
1、試劑和材料
除另有規(guī)定外,所用試劑均為分析純。實驗用水均符合GB/T6682-2008二級水規(guī)定LB液體培養(yǎng)基。
① 緩沖蛋白胨水(BPW)前增菌液；
② 亞硒酸鹽胱氨酸(SC)增菌液；
③ 四硫磺酸鹽煌綠(TTB)增菌液；
④ 木糖賴氨酸脫氧膽鹽(XLD)瓊脂 ；
⑤ TAE電泳緩沖液；
⑥ 陽性、陰性對照:陽性對照為腸炎沙門氏菌標準株(CVCC3377)培養(yǎng)液,雞白痢沙門氏；菌標準株(CVCC535)培養(yǎng)液;陰性對照為滅菌超純水；
⑦ 細菌基因組 DNA 提取試劑盒:商品化試劑盒；
⑧ 無水乙醇:-20 ℃預(yù)冷；
⑨ 75% 乙醇:無水乙醇和雙蒸水配制,-20 ℃預(yù)冷；
⑩ DNA 分子量標記:DNA Marker 2000；
⑪ 瓊脂糖；
⑫ 七個持家基因片段的 PCR 引物序列；
⑬ 2×PCR Mix。
2、儀器和設(shè)備
① Pipetty Pro電動移液器，MSIC01-03-20、MSIC01-03-250、MSIC01-03-1000；
② 恒溫培養(yǎng)箱(溫度范圍:5 ℃ ~ 50 ℃,溫度均勻度:≤ ±1 ℃)；
③ 高壓滅菌鍋(滅菌溫度:105 ℃~ 135 ℃,工作壓力:< 0.35 MPa)；
④ 電子天平(感量 0.001 g)；
⑤ 高速離心機(可控溫至4℃、離心速度可達 12000 r/min 以上)；
⑥ 二級生物安全柜；
⑦ 4 ℃冰箱(溫控范圍2℃~8℃);-20℃冰箱；
⑧ PCR 儀；
⑨ 電泳儀(電壓 90 V~ 120 V)；
⑩ 電泳儀(電壓 90 V~ 120 V）；
⑪ 控溫搖床(溫度范圍:5 ℃~50 ℃,振蕩頻率:30 r/min ~ 300 r/min)；
⑫ 凝膠成像儀；
⑬ PCR 反應(yīng)管；
⑭ 1.5 mL帶蓋離心管。
三、實驗步驟
1、將初步鑒定為沙門氏菌的菌株用商品化試劑盒進行基因組 DNA 提取。提取方法按試劑盒說明書要求進行。
2、設(shè)計合成七個持家基因的引物。引物DNA 列參見 B.1。
3、用 B.1中所列七對引物對樣品基因組 DNA 的七個持家基因分別進行 PCR 擴增。使用Pipetty電動移液器，連續(xù)分液模式，設(shè)置單次分液體積25μl，完成96孔板的預(yù)混液分裝，更換吸頭，再將引物、模板、無菌水等依次加入。
4、PCR反應(yīng)程序:94 ℃5 min;94 ℃ 45 s,55 ℃ 45 s,72 ℃1 min,共 35 個循環(huán);72 ℃7 min;4 ℃保存。
5、使用Pipetty電動移液器，取5μL~ 10 μL PCR 產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳,電泳結(jié)束后,用凝膠成像儀觀察結(jié)果。
6、將七個持家基因均擴增出特異性條帶的PCR產(chǎn)物進行測序。
四、結(jié)果判定
1、利用 B.1 規(guī)定的七對引物,陽性對照菌株 PCR 產(chǎn)物電泳后分別出現(xiàn)七條特異性的擴增條帶,陰性對照 PCR 產(chǎn)物無擴增條帶,試驗結(jié)果成立。否則試驗不成立。七個持家基因的 PCR 產(chǎn)物電泳圖參見圖C1。
2、 使用 DNA 序列分析軟件,將七個持家基因 PCR產(chǎn)物 DNA序列與參考序列分別進行一對一比對。
3、七個基因的測序結(jié)果與所對應(yīng)的參考序列均完全一致，則判斷樣品為腸炎沙門氏菌陽性
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