Pipetty 電動(dòng)移液器在牛羊副流感cELISA檢測(cè)中的應(yīng)用
方案摘要：本方案針對(duì)牛羊副流感病毒抗體cELISA檢測(cè)的精準(zhǔn)性與高效性需求，整合Pipetty電動(dòng)移液器的核心優(yōu)勢(shì)，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)流程。該移液器具備連續(xù)分液功能，可實(shí)現(xiàn)多孔試劑的均勻精準(zhǔn)分配；其自動(dòng)記憶六次分液程序一鍵調(diào)節(jié)分液次數(shù)的特性，能大幅簡(jiǎn)化手動(dòng)調(diào)節(jié)分液量的操作，減少人為誤差與操作耗時(shí)。方案通過補(bǔ)足實(shí)驗(yàn)原理、優(yōu)化操作步驟，明確借助該移液器完成樣品稀釋、加樣、抗體添加等關(guān)鍵環(huán)節(jié)，結(jié)合cELISA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合機(jī)制實(shí)現(xiàn)抗體定性檢測(cè)，為牛羊副流感疫病的快速篩查、流行病學(xué)監(jiān)測(cè)提供穩(wěn)定可靠的技術(shù)支撐，提升基層實(shí)驗(yàn)室與規(guī)�；瘷z疫的檢測(cè)效率。
方案詳情：
二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1、儀器設(shè)配
除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外,其他設(shè)備和材料如下：
① Pipetty 電動(dòng)移液器MSIC01-03-20、MSIC01-03-250、MSIC01-03-1000及吸頭；
② 臺(tái)式離心機(jī)；
③ 往復(fù)式微量振蕩器；
④ 渦旋混合振蕩器；
④ 酶標(biāo)儀；
⑤ 洗板機(jī)；
⑥ 恒溫培養(yǎng)箱；
⑦ 冰箱(2-8℃、-20℃、-70℃等不同規(guī)格)；
2、試劑和材料
① 樣品稀釋緩沖液；
② 20倍濃縮洗滌液；
③ 終止液；
④ TMB底物顯色液；
⑤ 病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清；
⑥ 病毒標(biāo)準(zhǔn)陰性血清；
⑦ 抗原包被酶標(biāo)板；
⑧ 酶標(biāo)單克隆抗體。
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1、將所有試劑從冰箱取出，平衡至室溫；取出20倍濃縮洗滌液充分混懸，確認(rèn)析出的鹽類完全溶解后，用去離子水按1:20比例稀釋備用。提前調(diào)試Pipetty電動(dòng)移液器，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，利用其自動(dòng)記憶功能預(yù)設(shè)3-4組常用分液程序，后續(xù)可一鍵切換，減少操作中的參數(shù)設(shè)置時(shí)長(zhǎng)。
2、取出包被病毒抗原的酶標(biāo)板，使用Pipetty電動(dòng)移液器的連續(xù)分液功能，向每孔精準(zhǔn)加入40μL樣品稀釋緩沖液；更換吸頭，向樣品孔加入10μL制備好的待檢血清；更換吸頭，同步向2個(gè)陽性對(duì)照孔、2個(gè)陰性對(duì)照孔分別加入10μL陽性血清、陰性血清；更換吸頭，最后向2個(gè)空白對(duì)照孔各加入50μL樣品稀釋緩沖液。
3、用樣品稀釋緩沖液將酶標(biāo)單克隆抗體稀釋至工作濃度，使用連續(xù)分液功能，每孔加入50μL，輕輕振蕩酶標(biāo)板，使血清與酶標(biāo)單克隆抗體反應(yīng)液充分混勻，37C孵育60min。
4、取出酶標(biāo)板，迅速甩出酶標(biāo)板內(nèi)的溶液至含有滅活劑的廢液缸中。每孔加入300μL洗滌液，迅速翻轉(zhuǎn)酶標(biāo)板將孔內(nèi)洗滌液甩至盛有滅活劑的廢液缸中，將酶標(biāo)板倒置在干凈的吸水紙上，拍干。洗滌3次~5次。
5、使用連續(xù)分液功能，每孔加入l00μL TMB底物顯色液，37C孵育10min。
6、每孔加入50μL終止液。
7、加入終止液后，于450nm波長(zhǎng)下，讀取每孔的OD值。
8、血清阻斷率的計(jì)算見公式(1):
PI=(1-S/N)x100%......................(1)
式中:
PI 血清阻斷率;
S 陽性對(duì)照或陰性對(duì)照或待檢樣品的OD值;
N 空白對(duì)照OD平均值。
四、結(jié)果判定
1、當(dāng)空白對(duì)照孔0.8≤OD值≤1.5、陽性對(duì)照孔PI>80%、陰性對(duì)照孔PI≤30%時(shí)，判為試驗(yàn)成立，否則重新進(jìn)行試驗(yàn)。
2、當(dāng)被檢牛血清樣品的PI＞38%時(shí)，判定為血清抗體陽性；當(dāng)被檢羊血清樣品的PI＞35%時(shí)，判定為血清抗體陽性。當(dāng)被檢牛血清樣品的PI≤38%時(shí)，判定為血清抗體陰性;被檢羊血清樣品的PI≤35%時(shí)，判定為血清抗體陰性。
方案詳情：
- 實(shí)驗(yàn)原理
二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1、儀器設(shè)配
除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外,其他設(shè)備和材料如下：
① Pipetty 電動(dòng)移液器MSIC01-03-20、MSIC01-03-250、MSIC01-03-1000及吸頭；
② 臺(tái)式離心機(jī)；
③ 往復(fù)式微量振蕩器；
④ 渦旋混合振蕩器；
④ 酶標(biāo)儀；
⑤ 洗板機(jī)；
⑥ 恒溫培養(yǎng)箱；
⑦ 冰箱(2-8℃、-20℃、-70℃等不同規(guī)格)；
2、試劑和材料
① 樣品稀釋緩沖液；
② 20倍濃縮洗滌液；
③ 終止液；
④ TMB底物顯色液；
⑤ 病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清；
⑥ 病毒標(biāo)準(zhǔn)陰性血清；
⑦ 抗原包被酶標(biāo)板；
⑧ 酶標(biāo)單克隆抗體。
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1、將所有試劑從冰箱取出，平衡至室溫；取出20倍濃縮洗滌液充分混懸，確認(rèn)析出的鹽類完全溶解后，用去離子水按1:20比例稀釋備用。提前調(diào)試Pipetty電動(dòng)移液器，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，利用其自動(dòng)記憶功能預(yù)設(shè)3-4組常用分液程序，后續(xù)可一鍵切換，減少操作中的參數(shù)設(shè)置時(shí)長(zhǎng)。
2、取出包被病毒抗原的酶標(biāo)板，使用Pipetty電動(dòng)移液器的連續(xù)分液功能，向每孔精準(zhǔn)加入40μL樣品稀釋緩沖液；更換吸頭，向樣品孔加入10μL制備好的待檢血清；更換吸頭，同步向2個(gè)陽性對(duì)照孔、2個(gè)陰性對(duì)照孔分別加入10μL陽性血清、陰性血清；更換吸頭，最后向2個(gè)空白對(duì)照孔各加入50μL樣品稀釋緩沖液。
3、用樣品稀釋緩沖液將酶標(biāo)單克隆抗體稀釋至工作濃度，使用連續(xù)分液功能，每孔加入50μL，輕輕振蕩酶標(biāo)板，使血清與酶標(biāo)單克隆抗體反應(yīng)液充分混勻，37C孵育60min。
4、取出酶標(biāo)板，迅速甩出酶標(biāo)板內(nèi)的溶液至含有滅活劑的廢液缸中。每孔加入300μL洗滌液，迅速翻轉(zhuǎn)酶標(biāo)板將孔內(nèi)洗滌液甩至盛有滅活劑的廢液缸中，將酶標(biāo)板倒置在干凈的吸水紙上，拍干。洗滌3次~5次。
5、使用連續(xù)分液功能，每孔加入l00μL TMB底物顯色液，37C孵育10min。
6、每孔加入50μL終止液。
7、加入終止液后，于450nm波長(zhǎng)下，讀取每孔的OD值。
8、血清阻斷率的計(jì)算見公式(1):
PI=(1-S/N)x100%......................(1)
式中:
PI 血清阻斷率;
S 陽性對(duì)照或陰性對(duì)照或待檢樣品的OD值;
N 空白對(duì)照OD平均值。
四、結(jié)果判定
1、當(dāng)空白對(duì)照孔0.8≤OD值≤1.5、陽性對(duì)照孔PI>80%、陰性對(duì)照孔PI≤30%時(shí)，判為試驗(yàn)成立，否則重新進(jìn)行試驗(yàn)。
2、當(dāng)被檢牛血清樣品的PI＞38%時(shí)，判定為血清抗體陽性；當(dāng)被檢羊血清樣品的PI＞35%時(shí)，判定為血清抗體陽性。當(dāng)被檢牛血清樣品的PI≤38%時(shí)，判定為血清抗體陰性;被檢羊血清樣品的PI≤35%時(shí)，判定為血清抗體陰性。
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