牛羊副流感熒光RT-PCR檢測(cè)的原理與實(shí)驗(yàn)流程
方案摘要：本方案旨在建立基于Pipetty電動(dòng)移液器的牛羊副流感（BPIV3/CPIV3病毒核酸精準(zhǔn)檢測(cè)流程。通過Pipetty電動(dòng)移液器的高精度移液與連續(xù)分液功能，實(shí)現(xiàn)樣本核酸提取、RT-PCR反應(yīng)體系配制、產(chǎn)物移取等全流程標(biāo)準(zhǔn)化操作，規(guī)避手動(dòng)移液誤差。流程核心為：樣本預(yù)處理后提取病毒RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，精準(zhǔn)配制PCR反應(yīng)體系并設(shè)置陰陽(yáng)性對(duì)照，上機(jī)擴(kuò)增后通過瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。該方案借助Pipetty電動(dòng)移液器的溫度補(bǔ)償、輕便操作等優(yōu)勢(shì)，提升檢測(cè)效率與結(jié)果可靠性，適配養(yǎng)殖場(chǎng)、檢測(cè)機(jī)構(gòu)等批量牛羊樣本的副流感病毒快速篩查。
方案詳情：
- 實(shí)驗(yàn)原理
二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1、儀器設(shè)配
除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外,其他設(shè)備和材料如下：
① Pipetty Pro 電動(dòng)移液器MSIC01-03-20、MSIC01-03-250、MSIC01-03-1000；
② PCR 儀；
③ 電泳儀和水平電泳槽；
④ 凝膠成像儀或紫外透射儀；
⑤ 臺(tái)式離心機(jī)；
⑥ 高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)；
⑦ 冰箱(2C~8℃、-20℃、-70℃等不同規(guī)格)；
⑧ 生物安全柜。
2、試劑和材料
① 引物；
② BPIV3陽(yáng)性對(duì)照；
③ CPIV3陽(yáng)性對(duì)照；
④ 病毒RNA提取試劑盒；
⑤ 反轉(zhuǎn)錄試劑盒；
⑥ PCR預(yù)混液或一步法RT-PCR預(yù)混液；
⑦ 離心管(0.5mL、1.5mL、2mL、10mL、50mL等不同規(guī)格)；
⑧ PCR反應(yīng)管。
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1、樣本經(jīng)預(yù)處理后取上清，采用Pipetty電動(dòng)移液器精準(zhǔn)移取樣本至提取管，配合病毒RNA提取試劑盒完成核酸提取。
2、用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的核酸進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得的cDNA置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆�。若使用一步法RT-PCR預(yù)混液可省略此步驟。
3、將PCR反應(yīng)各試劑于冰上融化后，借助Pipetty電動(dòng)移液器的高精度連續(xù)分液功能，配制RT-PCR反應(yīng)體系，將cDNA模板分別加入相應(yīng)PCR反應(yīng)管中，同時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照(去離子水)，對(duì)PCR反應(yīng)管進(jìn)行編號(hào)。蓋緊管蓋后，500r/min離心30s。
上游引物（10 μmol/L） 0.5μL
下游引物（10 μmol/L） 0.5μL
2×PCR Mix 12.5μL
無核酶水 9.5μL
cDNA模板 2.0μL
總體積 25.0μL
4、將加樣后的PCR反應(yīng)管放入PCR儀中，按照表D.2中BPIV3或CPIV3的RT-PCR反應(yīng)程序進(jìn)行。若采用一步法RT-PCR預(yù)混液，可按照說明書操作。
5、 用Pipetty取PCR產(chǎn)物5uL~10uL，在1%~1.2%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，使用凝膠成像系統(tǒng)或紫外透射儀觀察結(jié)果。
四、結(jié)果判定
1、陰性對(duì)照無擴(kuò)增條帶，陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)符合大小的特異擴(kuò)增條帶，判為試驗(yàn)成立。
2、樣品出現(xiàn)預(yù)期大小的擴(kuò)增片段時(shí)，判定為病毒核酸檢測(cè)陽(yáng)性。樣品未出現(xiàn)預(yù)期大小的擴(kuò)增片段，判定病毒核酸檢測(cè)陰性。BPIV3和CPIV3陽(yáng)性結(jié)果對(duì)照?qǐng)D分別見圖E.l和圖E.2。
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