Cytiva高親和廣譜層析填料應用：破解慢病毒純化核心難題
近年來隨著基因治療持續(xù)發(fā)展，使得業(yè)界對慢病毒載體（Lentiviral vectors，LVs）規(guī)�；�、低成本的純化工藝產生了濃厚興趣。目前，實驗室規(guī)模普遍采用超速離心法對慢病毒進行純化。雖然可獲得高濃度慢病毒，但存在明顯局限性比如穩(wěn)定性差，長時間處理會導致部分載體失活；殘留雜質可能引發(fā)非預期效應或降低療效；回收率低且難以放大等。
慢病毒是一種直徑80-120 nm的對稱球形包膜病毒，由包膜蛋白、包膜、基質蛋白、衣殼、兩條單鏈RNA、逆轉錄酶、整合酶和蛋白酶組成。在基因治療領域，慢病毒因其高效轉導和長期表達的特性成為遞送基因的“明星工具”。
慢病毒下游純化工藝三大難點
1.病毒脆弱，活性難保
慢病毒像“嬌貴的泡泡”，純化過程中容易因剪切力、壓力變化、溶液pH和鹽濃度波動導致失活。
慢病毒穩(wěn)定性差，初期研究發(fā)現(xiàn)，澄清后的慢病毒樣品在室溫靜置保存2小時后活性滴度會下降約20%。
2.雜質難除，安全存憂
慢病毒在收獲時，細胞活率較低，慢病毒培養(yǎng)上清中混雜著宿主細胞分泌的蛋白質（HCP）和DNA（HCD），傳統(tǒng)方法難以徹底清除。
慢病毒與游離DNA通過電荷相互作用[5]、空間位阻效應[6]可以形成大顆粒復合物，進一步影響雜質的去除。
3.下游純化，收率低
慢病毒收獲液濁度較高，濾膜容易堵塞，澄清時回收率低。
經(jīng)電鏡實測慢病毒的直徑在80-120 nm之間，且容易形成＞200 nm的大顆粒，導致在除菌過濾時回收率較低。
Cytiva Fast Trak破解之道
1. 突破穩(wěn)定性瓶頸
溫和且快速的純化工藝：Hollow Fiber因為條件溫和，剪切力低，對于自身穩(wěn)定性差的慢病毒較為友好，所以選用Hollow Fiber對慢病毒進行濃縮/換液。Cytiva的Capto Core 700層析為流穿模式，在保證雜質去除能力的前提下工藝時間更短，Capto Core 700層析回收率可以達到90%。
選擇適合的緩沖液：不要使用高鹽或極端pH緩沖液可以有效避免病毒顆粒解體。另外可以添加蔗糖或者葡萄糖等作為保護劑，保護病毒結構。
2. 增強雜質去除力
酶切條件優(yōu)化：在慢病毒純化工藝中使用核酸酶對收獲液進行酶處理以降解各種形式的DNA和RNA，從而達到去除樣品中核酸的目的。同時考慮到工藝經(jīng)濟性的問題，對全能核酸酶的酶切濃度、溫度和時長進行了優(yōu)化。優(yōu)化后酶處理工藝可以降解99%以上的HCD。
復合模式層析：Cytiva的Capto Core 700為復合模式層析填料，表層是具有一定孔徑的鈍化層，慢病毒等大于700 kDa的大分子可以經(jīng)過外水直接流穿。較小的分子如RNA片段、HCP和內毒素片段等經(jīng)過小孔進入內核，與微球內的配基吸附結合，可以實現(xiàn)慢病毒和雜質的分離。
3.提高病毒回收率
澄清工藝：采用Hollow Fiber進行澄清具有低剪切力的優(yōu)勢，選用0.65 μm的中空纖維柱進行澄清。在澄清工藝中特別是對透過通量進行了研究，從圖4中可以看到透過通量保持穩(wěn)定，工藝過程中跨膜壓也較低。經(jīng)優(yōu)化，澄清步驟回收率顯著提高。
除菌過濾：為提高慢病毒除菌過濾工藝的回收率，一方面可進行濾器篩選，另一方面對濾器載量和過濾速度進行優(yōu)化。優(yōu)化后除菌過濾的慢病毒回收率可達到80%，大大提高了下游純化工藝的整體回收率。
層析填料介紹
Cytiva（思拓凡）——Capto Core 700 多模式層析填料
產品詳情
Capto™ 填料基于堅硬的高流動性瓊脂糖基架，具有優(yōu)化的孔隙結構，可提供良好的壓力和流動性。這種填料旨在用于工藝開發(fā)和大規(guī)模制造，但也用于研究實驗室。它們的高流速可提高生產率和大批量加工能力。
Capto Core系列填料為雙層設計，表層是具有一定孔徑的鈍化層，它可以排阻大分子，使之流穿。小分子通過表層進入填料內部核心，核心層可以結合雜質分子。這一設計使得該系列填料具有分子排阻和吸附層析的雙重特點。該系列填料的優(yōu)點包括高載量、高流速、短保留時間、在寬操作窗口內保持強大性能、工藝設計簡單和生產效率高。
新型核心層析技術和多模式、辛胺配基賦予 Capto Core 700 多模式層析填料雙功能。具有分子排阻和結合特性。
產品優(yōu)點：
· 新型核心層析技術和多模式、辛胺配基賦予 Capto Core 700 多模式層析填料雙功能，具有分子排阻和結合特性。
· 新型核心層析技術可高效捕獲污染物，同時在流穿過程中收集靶分子。
· 與標準分子排阻（凝膠過濾）方法相比，顯著提高了生產率并提高了流速。
· 通過流穿層析法和穩(wěn)定的性能進行直接優(yōu)化。
· 使用預填充 HiTrap 和 HiScreen 層析柱進行便捷的小規(guī)模純化、工藝開發(fā)和規(guī)模擴大。
· 填料可滿足供應安全、性能穩(wěn)定和監(jiān)管支持方面的工業(yè)需要。
污染物的多模式去除：
Capto Core 700 多模式層析填料由配基活化核心和惰性外殼組成。惰性外殼不允許大分子（臨界值約為 Mr 700000）通過外殼的孔進入核內。在層析柱流穿過程中收集這些較大分子，而較小雜質與內化配基結合。
疏水性、帶正電荷的配基：
Capto Core 700多模式層析填料內核配基具有疏水性同時帶正電荷，從而可對小至足以進入核心的各種污染物進行高效多模式結合。多模式配基可確保在較寬的 pH 值和鹽濃度范圍內與大多數(shù)雜質強結合。通過使用 NaOH 和可在大多數(shù)情況下使用的溶劑進行的原位清潔 (CIP) 程序，從填料中去除結合的雜質。
規(guī)模放大較為簡單：
HiTrap 和 HiScreen 層析柱可串聯(lián)連接以增加載量，并且在開發(fā)高效且可靠的分離方法時可方便使用。
慢病毒是一種直徑80-120 nm的對稱球形包膜病毒，由包膜蛋白、包膜、基質蛋白、衣殼、兩條單鏈RNA、逆轉錄酶、整合酶和蛋白酶組成。在基因治療領域，慢病毒因其高效轉導和長期表達的特性成為遞送基因的“明星工具”。
慢病毒下游純化工藝三大難點
1.病毒脆弱，活性難保
慢病毒像“嬌貴的泡泡”，純化過程中容易因剪切力、壓力變化、溶液pH和鹽濃度波動導致失活。
慢病毒穩(wěn)定性差，初期研究發(fā)現(xiàn)，澄清后的慢病毒樣品在室溫靜置保存2小時后活性滴度會下降約20%。
2.雜質難除，安全存憂
慢病毒在收獲時，細胞活率較低，慢病毒培養(yǎng)上清中混雜著宿主細胞分泌的蛋白質（HCP）和DNA（HCD），傳統(tǒng)方法難以徹底清除。
慢病毒與游離DNA通過電荷相互作用[5]、空間位阻效應[6]可以形成大顆粒復合物，進一步影響雜質的去除。
3.下游純化，收率低
慢病毒收獲液濁度較高，濾膜容易堵塞，澄清時回收率低。
經(jīng)電鏡實測慢病毒的直徑在80-120 nm之間，且容易形成＞200 nm的大顆粒，導致在除菌過濾時回收率較低。
Cytiva Fast Trak破解之道
1. 突破穩(wěn)定性瓶頸
溫和且快速的純化工藝：Hollow Fiber因為條件溫和，剪切力低，對于自身穩(wěn)定性差的慢病毒較為友好，所以選用Hollow Fiber對慢病毒進行濃縮/換液。Cytiva的Capto Core 700層析為流穿模式，在保證雜質去除能力的前提下工藝時間更短，Capto Core 700層析回收率可以達到90%。
選擇適合的緩沖液：不要使用高鹽或極端pH緩沖液可以有效避免病毒顆粒解體。另外可以添加蔗糖或者葡萄糖等作為保護劑，保護病毒結構。
2. 增強雜質去除力
酶切條件優(yōu)化：在慢病毒純化工藝中使用核酸酶對收獲液進行酶處理以降解各種形式的DNA和RNA，從而達到去除樣品中核酸的目的。同時考慮到工藝經(jīng)濟性的問題，對全能核酸酶的酶切濃度、溫度和時長進行了優(yōu)化。優(yōu)化后酶處理工藝可以降解99%以上的HCD。
復合模式層析：Cytiva的Capto Core 700為復合模式層析填料，表層是具有一定孔徑的鈍化層，慢病毒等大于700 kDa的大分子可以經(jīng)過外水直接流穿。較小的分子如RNA片段、HCP和內毒素片段等經(jīng)過小孔進入內核，與微球內的配基吸附結合，可以實現(xiàn)慢病毒和雜質的分離。
3.提高病毒回收率
澄清工藝：采用Hollow Fiber進行澄清具有低剪切力的優(yōu)勢，選用0.65 μm的中空纖維柱進行澄清。在澄清工藝中特別是對透過通量進行了研究，從圖4中可以看到透過通量保持穩(wěn)定，工藝過程中跨膜壓也較低。經(jīng)優(yōu)化，澄清步驟回收率顯著提高。
除菌過濾：為提高慢病毒除菌過濾工藝的回收率，一方面可進行濾器篩選，另一方面對濾器載量和過濾速度進行優(yōu)化。優(yōu)化后除菌過濾的慢病毒回收率可達到80%，大大提高了下游純化工藝的整體回收率。層析填料介紹
Cytiva（思拓凡）——Capto Core 700 多模式層析填料
產品詳情
Capto™ 填料基于堅硬的高流動性瓊脂糖基架，具有優(yōu)化的孔隙結構，可提供良好的壓力和流動性。這種填料旨在用于工藝開發(fā)和大規(guī)模制造，但也用于研究實驗室。它們的高流速可提高生產率和大批量加工能力。
Capto Core系列填料為雙層設計，表層是具有一定孔徑的鈍化層，它可以排阻大分子，使之流穿。小分子通過表層進入填料內部核心，核心層可以結合雜質分子。這一設計使得該系列填料具有分子排阻和吸附層析的雙重特點。該系列填料的優(yōu)點包括高載量、高流速、短保留時間、在寬操作窗口內保持強大性能、工藝設計簡單和生產效率高。
新型核心層析技術和多模式、辛胺配基賦予 Capto Core 700 多模式層析填料雙功能。具有分子排阻和結合特性。
產品優(yōu)點：
· 新型核心層析技術和多模式、辛胺配基賦予 Capto Core 700 多模式層析填料雙功能，具有分子排阻和結合特性。
· 新型核心層析技術可高效捕獲污染物，同時在流穿過程中收集靶分子。
· 與標準分子排阻（凝膠過濾）方法相比，顯著提高了生產率并提高了流速。
· 通過流穿層析法和穩(wěn)定的性能進行直接優(yōu)化。
· 使用預填充 HiTrap 和 HiScreen 層析柱進行便捷的小規(guī)模純化、工藝開發(fā)和規(guī)模擴大。
· 填料可滿足供應安全、性能穩(wěn)定和監(jiān)管支持方面的工業(yè)需要。
污染物的多模式去除：
Capto Core 700 多模式層析填料由配基活化核心和惰性外殼組成。惰性外殼不允許大分子（臨界值約為 Mr 700000）通過外殼的孔進入核內。在層析柱流穿過程中收集這些較大分子，而較小雜質與內化配基結合。
疏水性、帶正電荷的配基：
Capto Core 700多模式層析填料內核配基具有疏水性同時帶正電荷，從而可對小至足以進入核心的各種污染物進行高效多模式結合。多模式配基可確保在較寬的 pH 值和鹽濃度范圍內與大多數(shù)雜質強結合。通過使用 NaOH 和可在大多數(shù)情況下使用的溶劑進行的原位清潔 (CIP) 程序，從填料中去除結合的雜質。
規(guī)模放大較為簡單：
HiTrap 和 HiScreen 層析柱可串聯(lián)連接以增加載量，并且在開發(fā)高效且可靠的分離方法時可方便使用。
在基因治療產業(yè)化的關鍵賽道上，慢病毒載體的高效純化是決定技術轉化與臨床應用的核心環(huán)節(jié)，而“高親和性”與“廣譜適應性”則是層析填料破解純化難題的核心訴求。傳統(tǒng)純化工藝面臨的病毒失活、雜質殘留、收率不足等痛點，本質上呼喚著兼具精準靶向、穩(wěn)定兼容與規(guī)�；瘽摿Φ奶盍辖鉀Q方案。
Cytiva（思拓凡）推出的Capto Core 700多模式層析填料，正是這一需求的理想應答者。其基于雙層結構設計與辛胺配基的創(chuàng)新組合，既憑借疏水性與正電荷的多模式結合特性，實現(xiàn)了對HCP、HCD、內毒素等各類雜質的高親和捕獲，又以700 kDa的分子排阻臨界值，為慢病毒等大分子載體提供了廣譜適配的流穿分離路徑，完美契合“高親和、廣適應”的核心要求。同時，溫和的工藝條件保障了病毒活性，優(yōu)化后的澄清、除菌過濾流程與填料的高流速、高載量優(yōu)勢，共同實現(xiàn)了回收率與生產效率的雙重提升，更兼顧了從實驗室研發(fā)到工業(yè)規(guī)�；a的無縫銜接。
未來，隨著病毒載體技術的多元化發(fā)展，對層析填料的性能要求將持續(xù)升級。Cytiva等秉持創(chuàng)新基因的品牌，將繼續(xù)以技術突破為核心，推動層析填料在親和性優(yōu)化、適配范圍拓展、工藝成本控制等方面不斷進階。這些優(yōu)質填料不僅是破解病毒純化瓶頸的關鍵工具，更將成為賦能基因治療、疫苗研發(fā)等生物制藥領域高質量發(fā)展的核心支撐，助力更多創(chuàng)新生物藥跨越技術鴻溝，安全高效地惠及全球患者。
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