Cytiva高親和廣譜層析填料應(yīng)用：破解慢病毒純化核心難題
近年來(lái)隨著基因治療持續(xù)發(fā)展，使得業(yè)界對(duì)慢病毒載體（Lentiviral vectors，LVs）規(guī)�；�、低成本的純化工藝產(chǎn)生了濃厚興趣。目前，實(shí)驗(yàn)室規(guī)模普遍采用超速離心法對(duì)慢病毒進(jìn)行純化。雖然可獲得高濃度慢病毒，但存在明顯局限性比如穩(wěn)定性差，長(zhǎng)時(shí)間處理會(huì)導(dǎo)致部分載體失活；殘留雜質(zhì)可能引發(fā)非預(yù)期效應(yīng)或降低療效；回收率低且難以放大等。
慢病毒是一種直徑80-120 nm的對(duì)稱球形包膜病毒，由包膜蛋白、包膜、基質(zhì)蛋白、衣殼、兩條單鏈RNA、逆轉(zhuǎn)錄酶、整合酶和蛋白酶組成。在基因治療領(lǐng)域，慢病毒因其高效轉(zhuǎn)導(dǎo)和長(zhǎng)期表達(dá)的特性成為遞送基因的“明星工具”。
慢病毒下游純化工藝三大難點(diǎn)
1.病毒脆弱，活性難保
慢病毒像“嬌貴的泡泡”，純化過(guò)程中容易因剪切力、壓力變化、溶液pH和鹽濃度波動(dòng)導(dǎo)致失活。
慢病毒穩(wěn)定性差，初期研究發(fā)現(xiàn)，澄清后的慢病毒樣品在室溫靜置保存2小時(shí)后活性滴度會(huì)下降約20%。
2.雜質(zhì)難除，安全存憂
慢病毒在收獲時(shí)，細(xì)胞活率較低，慢病毒培養(yǎng)上清中混雜著宿主細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)（HCP）和DNA（HCD），傳統(tǒng)方法難以徹底清除。
慢病毒與游離DNA通過(guò)電荷相互作用[5]、空間位阻效應(yīng)[6]可以形成大顆粒復(fù)合物，進(jìn)一步影響雜質(zhì)的去除。
3.下游純化，收率低
慢病毒收獲液濁度較高，濾膜容易堵塞，澄清時(shí)回收率低。
經(jīng)電鏡實(shí)測(cè)慢病毒的直徑在80-120 nm之間，且容易形成＞200 nm的大顆粒，導(dǎo)致在除菌過(guò)濾時(shí)回收率較低。
Cytiva Fast Trak破解之道
1. 突破穩(wěn)定性瓶頸
溫和且快速的純化工藝：Hollow Fiber因?yàn)闂l件溫和，剪切力低，對(duì)于自身穩(wěn)定性差的慢病毒較為友好，所以選用Hollow Fiber對(duì)慢病毒進(jìn)行濃縮/換液。Cytiva的Capto Core 700層析為流穿模式，在保證雜質(zhì)去除能力的前提下工藝時(shí)間更短，Capto Core 700層析回收率可以達(dá)到90%。
選擇適合的緩沖液：不要使用高鹽或極端pH緩沖液可以有效避免病毒顆粒解體。另外可以添加蔗糖或者葡萄糖等作為保護(hù)劑，保護(hù)病毒結(jié)構(gòu)。
2. 增強(qiáng)雜質(zhì)去除力
酶切條件優(yōu)化：在慢病毒純化工藝中使用核酸酶對(duì)收獲液進(jìn)行酶處理以降解各種形式的DNA和RNA，從而達(dá)到去除樣品中核酸的目的。同時(shí)考慮到工藝經(jīng)濟(jì)性的問(wèn)題，對(duì)全能核酸酶的酶切濃度、溫度和時(shí)長(zhǎng)進(jìn)行了優(yōu)化。優(yōu)化后酶處理工藝可以降解99%以上的HCD。
復(fù)合模式層析：Cytiva的Capto Core 700為復(fù)合模式層析填料，表層是具有一定孔徑的鈍化層，慢病毒等大于700 kDa的大分子可以經(jīng)過(guò)外水直接流穿。較小的分子如RNA片段、HCP和內(nèi)毒素片段等經(jīng)過(guò)小孔進(jìn)入內(nèi)核，與微球內(nèi)的配基吸附結(jié)合，可以實(shí)現(xiàn)慢病毒和雜質(zhì)的分離。
3.提高病毒回收率
澄清工藝：采用Hollow Fiber進(jìn)行澄清具有低剪切力的優(yōu)勢(shì)，選用0.65 μm的中空纖維柱進(jìn)行澄清。在澄清工藝中特別是對(duì)透過(guò)通量進(jìn)行了研究，從圖4中可以看到透過(guò)通量保持穩(wěn)定，工藝過(guò)程中跨膜壓也較低。經(jīng)優(yōu)化，澄清步驟回收率顯著提高。
除菌過(guò)濾：為提高慢病毒除菌過(guò)濾工藝的回收率，一方面可進(jìn)行濾器篩選，另一方面對(duì)濾器載量和過(guò)濾速度進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化后除菌過(guò)濾的慢病毒回收率可達(dá)到80%，大大提高了下游純化工藝的整體回收率。
層析填料介紹
Cytiva（思拓凡）——Capto Core 700 多模式層析填料
產(chǎn)品詳情
Capto™ 填料基于堅(jiān)硬的高流動(dòng)性瓊脂糖基架，具有優(yōu)化的孔隙結(jié)構(gòu)，可提供良好的壓力和流動(dòng)性。這種填料旨在用于工藝開(kāi)發(fā)和大規(guī)模制造，但也用于研究實(shí)驗(yàn)室。它們的高流速可提高生產(chǎn)率和大批量加工能力。
Capto Core系列填料為雙層設(shè)計(jì)，表層是具有一定孔徑的鈍化層，它可以排阻大分子，使之流穿。小分子通過(guò)表層進(jìn)入填料內(nèi)部核心，核心層可以結(jié)合雜質(zhì)分子。這一設(shè)計(jì)使得該系列填料具有分子排阻和吸附層析的雙重特點(diǎn)。該系列填料的優(yōu)點(diǎn)包括高載量、高流速、短保留時(shí)間、在寬操作窗口內(nèi)保持強(qiáng)大性能、工藝設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單和生產(chǎn)效率高。
新型核心層析技術(shù)和多模式、辛胺配基賦予 Capto Core 700 多模式層析填料雙功能。具有分子排阻和結(jié)合特性。
產(chǎn)品優(yōu)點(diǎn)：
· 新型核心層析技術(shù)和多模式、辛胺配基賦予 Capto Core 700 多模式層析填料雙功能，具有分子排阻和結(jié)合特性。
· 新型核心層析技術(shù)可高效捕獲污染物，同時(shí)在流穿過(guò)程中收集靶分子。
· 與標(biāo)準(zhǔn)分子排阻（凝膠過(guò)濾）方法相比，顯著提高了生產(chǎn)率并提高了流速。
· 通過(guò)流穿層析法和穩(wěn)定的性能進(jìn)行直接優(yōu)化。
· 使用預(yù)填充 HiTrap 和 HiScreen 層析柱進(jìn)行便捷的小規(guī)模純化、工藝開(kāi)發(fā)和規(guī)模擴(kuò)大。
· 填料可滿足供應(yīng)安全、性能穩(wěn)定和監(jiān)管支持方面的工業(yè)需要。
污染物的多模式去除：
Capto Core 700 多模式層析填料由配基活化核心和惰性外殼組成。惰性外殼不允許大分子（臨界值約為 Mr 700000）通過(guò)外殼的孔進(jìn)入核內(nèi)。在層析柱流穿過(guò)程中收集這些較大分子，而較小雜質(zhì)與內(nèi)化配基結(jié)合。
疏水性、帶正電荷的配基：
Capto Core 700多模式層析填料內(nèi)核配基具有疏水性同時(shí)帶正電荷，從而可對(duì)小至足以進(jìn)入核心的各種污染物進(jìn)行高效多模式結(jié)合。多模式配基可確保在較寬的 pH 值和鹽濃度范圍內(nèi)與大多數(shù)雜質(zhì)強(qiáng)結(jié)合。通過(guò)使用 NaOH 和可在大多數(shù)情況下使用的溶劑進(jìn)行的原位清潔 (CIP) 程序，從填料中去除結(jié)合的雜質(zhì)。
規(guī)模放大較為簡(jiǎn)單：
HiTrap 和 HiScreen 層析柱可串聯(lián)連接以增加載量，并且在開(kāi)發(fā)高效且可靠的分離方法時(shí)可方便使用。
慢病毒是一種直徑80-120 nm的對(duì)稱球形包膜病毒，由包膜蛋白、包膜、基質(zhì)蛋白、衣殼、兩條單鏈RNA、逆轉(zhuǎn)錄酶、整合酶和蛋白酶組成。在基因治療領(lǐng)域，慢病毒因其高效轉(zhuǎn)導(dǎo)和長(zhǎng)期表達(dá)的特性成為遞送基因的“明星工具”。
慢病毒下游純化工藝三大難點(diǎn)
1.病毒脆弱，活性難保
慢病毒像“嬌貴的泡泡”，純化過(guò)程中容易因剪切力、壓力變化、溶液pH和鹽濃度波動(dòng)導(dǎo)致失活。
慢病毒穩(wěn)定性差，初期研究發(fā)現(xiàn)，澄清后的慢病毒樣品在室溫靜置保存2小時(shí)后活性滴度會(huì)下降約20%。
2.雜質(zhì)難除，安全存憂
慢病毒在收獲時(shí)，細(xì)胞活率較低，慢病毒培養(yǎng)上清中混雜著宿主細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)（HCP）和DNA（HCD），傳統(tǒng)方法難以徹底清除。
慢病毒與游離DNA通過(guò)電荷相互作用[5]、空間位阻效應(yīng)[6]可以形成大顆粒復(fù)合物，進(jìn)一步影響雜質(zhì)的去除。
3.下游純化，收率低
慢病毒收獲液濁度較高，濾膜容易堵塞，澄清時(shí)回收率低。
經(jīng)電鏡實(shí)測(cè)慢病毒的直徑在80-120 nm之間，且容易形成＞200 nm的大顆粒，導(dǎo)致在除菌過(guò)濾時(shí)回收率較低。
Cytiva Fast Trak破解之道
1. 突破穩(wěn)定性瓶頸
溫和且快速的純化工藝：Hollow Fiber因?yàn)闂l件溫和，剪切力低，對(duì)于自身穩(wěn)定性差的慢病毒較為友好，所以選用Hollow Fiber對(duì)慢病毒進(jìn)行濃縮/換液。Cytiva的Capto Core 700層析為流穿模式，在保證雜質(zhì)去除能力的前提下工藝時(shí)間更短，Capto Core 700層析回收率可以達(dá)到90%。
選擇適合的緩沖液：不要使用高鹽或極端pH緩沖液可以有效避免病毒顆粒解體。另外可以添加蔗糖或者葡萄糖等作為保護(hù)劑，保護(hù)病毒結(jié)構(gòu)。
2. 增強(qiáng)雜質(zhì)去除力
酶切條件優(yōu)化：在慢病毒純化工藝中使用核酸酶對(duì)收獲液進(jìn)行酶處理以降解各種形式的DNA和RNA，從而達(dá)到去除樣品中核酸的目的。同時(shí)考慮到工藝經(jīng)濟(jì)性的問(wèn)題，對(duì)全能核酸酶的酶切濃度、溫度和時(shí)長(zhǎng)進(jìn)行了優(yōu)化。優(yōu)化后酶處理工藝可以降解99%以上的HCD。
復(fù)合模式層析：Cytiva的Capto Core 700為復(fù)合模式層析填料，表層是具有一定孔徑的鈍化層，慢病毒等大于700 kDa的大分子可以經(jīng)過(guò)外水直接流穿。較小的分子如RNA片段、HCP和內(nèi)毒素片段等經(jīng)過(guò)小孔進(jìn)入內(nèi)核，與微球內(nèi)的配基吸附結(jié)合，可以實(shí)現(xiàn)慢病毒和雜質(zhì)的分離。
3.提高病毒回收率
澄清工藝：采用Hollow Fiber進(jìn)行澄清具有低剪切力的優(yōu)勢(shì)，選用0.65 μm的中空纖維柱進(jìn)行澄清。在澄清工藝中特別是對(duì)透過(guò)通量進(jìn)行了研究，從圖4中可以看到透過(guò)通量保持穩(wěn)定，工藝過(guò)程中跨膜壓也較低。經(jīng)優(yōu)化，澄清步驟回收率顯著提高。
除菌過(guò)濾：為提高慢病毒除菌過(guò)濾工藝的回收率，一方面可進(jìn)行濾器篩選，另一方面對(duì)濾器載量和過(guò)濾速度進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化后除菌過(guò)濾的慢病毒回收率可達(dá)到80%，大大提高了下游純化工藝的整體回收率。層析填料介紹
Cytiva（思拓凡）——Capto Core 700 多模式層析填料
產(chǎn)品詳情
Capto™ 填料基于堅(jiān)硬的高流動(dòng)性瓊脂糖基架，具有優(yōu)化的孔隙結(jié)構(gòu)，可提供良好的壓力和流動(dòng)性。這種填料旨在用于工藝開(kāi)發(fā)和大規(guī)模制造，但也用于研究實(shí)驗(yàn)室。它們的高流速可提高生產(chǎn)率和大批量加工能力。
Capto Core系列填料為雙層設(shè)計(jì)，表層是具有一定孔徑的鈍化層，它可以排阻大分子，使之流穿。小分子通過(guò)表層進(jìn)入填料內(nèi)部核心，核心層可以結(jié)合雜質(zhì)分子。這一設(shè)計(jì)使得該系列填料具有分子排阻和吸附層析的雙重特點(diǎn)。該系列填料的優(yōu)點(diǎn)包括高載量、高流速、短保留時(shí)間、在寬操作窗口內(nèi)保持強(qiáng)大性能、工藝設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單和生產(chǎn)效率高。
新型核心層析技術(shù)和多模式、辛胺配基賦予 Capto Core 700 多模式層析填料雙功能。具有分子排阻和結(jié)合特性。
產(chǎn)品優(yōu)點(diǎn)：
· 新型核心層析技術(shù)和多模式、辛胺配基賦予 Capto Core 700 多模式層析填料雙功能，具有分子排阻和結(jié)合特性。
· 新型核心層析技術(shù)可高效捕獲污染物，同時(shí)在流穿過(guò)程中收集靶分子。
· 與標(biāo)準(zhǔn)分子排阻（凝膠過(guò)濾）方法相比，顯著提高了生產(chǎn)率并提高了流速。
· 通過(guò)流穿層析法和穩(wěn)定的性能進(jìn)行直接優(yōu)化。
· 使用預(yù)填充 HiTrap 和 HiScreen 層析柱進(jìn)行便捷的小規(guī)模純化、工藝開(kāi)發(fā)和規(guī)模擴(kuò)大。
· 填料可滿足供應(yīng)安全、性能穩(wěn)定和監(jiān)管支持方面的工業(yè)需要。
污染物的多模式去除：
Capto Core 700 多模式層析填料由配基活化核心和惰性外殼組成。惰性外殼不允許大分子（臨界值約為 Mr 700000）通過(guò)外殼的孔進(jìn)入核內(nèi)。在層析柱流穿過(guò)程中收集這些較大分子，而較小雜質(zhì)與內(nèi)化配基結(jié)合。
疏水性、帶正電荷的配基：
Capto Core 700多模式層析填料內(nèi)核配基具有疏水性同時(shí)帶正電荷，從而可對(duì)小至足以進(jìn)入核心的各種污染物進(jìn)行高效多模式結(jié)合。多模式配基可確保在較寬的 pH 值和鹽濃度范圍內(nèi)與大多數(shù)雜質(zhì)強(qiáng)結(jié)合。通過(guò)使用 NaOH 和可在大多數(shù)情況下使用的溶劑進(jìn)行的原位清潔 (CIP) 程序，從填料中去除結(jié)合的雜質(zhì)。
規(guī)模放大較為簡(jiǎn)單：
HiTrap 和 HiScreen 層析柱可串聯(lián)連接以增加載量，并且在開(kāi)發(fā)高效且可靠的分離方法時(shí)可方便使用。
在基因治療產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵賽道上，慢病毒載體的高效純化是決定技術(shù)轉(zhuǎn)化與臨床應(yīng)用的核心環(huán)節(jié)，而“高親和性”與“廣譜適應(yīng)性”則是層析填料破解純化難題的核心訴求。傳統(tǒng)純化工藝面臨的病毒失活、雜質(zhì)殘留、收率不足等痛點(diǎn)，本質(zhì)上呼喚著兼具精準(zhǔn)靶向、穩(wěn)定兼容與規(guī)�；瘽摿Φ奶盍辖鉀Q方案。
Cytiva（思拓凡）推出的Capto Core 700多模式層析填料，正是這一需求的理想應(yīng)答者。其基于雙層結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)與辛胺配基的創(chuàng)新組合，既憑借疏水性與正電荷的多模式結(jié)合特性，實(shí)現(xiàn)了對(duì)HCP、HCD、內(nèi)毒素等各類雜質(zhì)的高親和捕獲，又以700 kDa的分子排阻臨界值，為慢病毒等大分子載體提供了廣譜適配的流穿分離路徑，完美契合“高親和、廣適應(yīng)”的核心要求。同時(shí)，溫和的工藝條件保障了病毒活性，優(yōu)化后的澄清、除菌過(guò)濾流程與填料的高流速、高載量?jī)?yōu)勢(shì)，共同實(shí)現(xiàn)了回收率與生產(chǎn)效率的雙重提升，更兼顧了從實(shí)驗(yàn)室研發(fā)到工業(yè)規(guī)�；a(chǎn)的無(wú)縫銜接。
未來(lái)，隨著病毒載體技術(shù)的多元化發(fā)展，對(duì)層析填料的性能要求將持續(xù)升級(jí)。Cytiva等秉持創(chuàng)新基因的品牌，將繼續(xù)以技術(shù)突破為核心，推動(dòng)層析填料在親和性優(yōu)化、適配范圍拓展、工藝成本控制等方面不斷進(jìn)階。這些優(yōu)質(zhì)填料不僅是破解病毒純化瓶頸的關(guān)鍵工具，更將成為賦能基因治療、疫苗研發(fā)等生物制藥領(lǐng)域高質(zhì)量發(fā)展的核心支撐，助力更多創(chuàng)新生物藥跨越技術(shù)鴻溝，安全高效地惠及全球患者。
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