文章來源公眾號(hào)：戴草帽的漁夫               作者：戴草帽的漁夫

SDE-100是靶點(diǎn)為CD25特異性抗體藥物偶聯(lián)物（ADC）。白血病患者體內(nèi)的癌變白細(xì)胞表
高表達(dá)CD25。生物學(xué)活性選用了人非霍奇金大細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞Karpass 299細(xì)胞系，該細(xì)胞系細(xì)胞膜表面高表達(dá)CD25。

在進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)之前，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行了4周時(shí)間的培養(yǎng)，監(jiān)測(cè)其生長(zhǎng)速率，以確定細(xì)胞倍增時(shí)間。這個(gè)步驟非常關(guān)鍵，因?yàn)橛糜谂悸?lián)抗體的小分子毒素MMAE與微管蛋白的相互作用只有在細(xì)胞分裂或嘗試分裂時(shí)才會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

研究表明，Karpass 299細(xì)胞的倍增時(shí)間約為30小時(shí)，且需要大約三次倍增才能使活細(xì)胞和死細(xì)胞之間產(chǎn)生顯著差異，從而便于在檢測(cè)中識(shí)別。因此，該細(xì)胞的培養(yǎng)時(shí)間可為檢測(cè)方法開發(fā)的早期階段確定藥物與細(xì)胞的初始孵育時(shí)間提供參考。

在細(xì)胞培養(yǎng)初期，該團(tuán)隊(duì)建立了兩級(jí)細(xì)胞庫，一個(gè)主細(xì)胞庫和兩個(gè)工作細(xì)胞庫。通過使用工作細(xì)胞庫，能夠確保所有實(shí)驗(yàn)均使用同一代細(xì)胞，從而降低細(xì)胞間的變異性。

細(xì)胞生物活性測(cè)定
1.將Karpass 299細(xì)胞接種于96孔板中，使其分布均勻。藥物以濃度梯度的形式加入到96孔板中，高濃度位于孔板頂部，低濃度位于孔板底部，細(xì)胞與藥物共同孵育5天；

2.取出孵育5天的96孔板，加入MTS檢測(cè)試劑。MTS為一種四唑化合物，其檢測(cè)原理為黃色的MTS在煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NA）存在下會(huì)被還原成藍(lán)紫色的甲臜，NADPH用于檢測(cè)活細(xì)胞，死細(xì)胞顯示黃色，活細(xì)胞孔則為藍(lán)色。在加入MTS孵育3小時(shí)后，觀測(cè)到孔板內(nèi)顏色從黃色逐漸變?yōu)樗{(lán)色（由上而下），顏色變化與藥物濃度呈正相關(guān)；

3.用酶標(biāo)儀讀取OD490 nm吸收光，OD值高表示活細(xì)胞數(shù)量多，OD值低表示死細(xì)胞數(shù)量多。結(jié)果見圖1：

ADC SDE-100的方法開發(fā)
開發(fā)檢測(cè)方法時(shí)，首先需要研究抗體及其抗體藥物偶聯(lián)物（ADC）的各種作用機(jī)制。
1）抗體與靶點(diǎn)結(jié)合可能產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用，例如通過抑制生長(zhǎng)因子受體的二聚化和激活
2）抗體的可結(jié)晶片段（FC）尾部也可能通過抗體依賴性細(xì)胞毒性（ADCC）、抗體依賴性吞噬作用（ADP）或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性（CDC）募集免疫系統(tǒng)的細(xì)胞毒性成分。

在抗體藥物偶聯(lián)物（ADC）中，除了藥物介導(dǎo)的細(xì)胞毒性外，還可能誘導(dǎo)產(chǎn)生這些細(xì)胞毒性效應(yīng)。因此，可能需要開發(fā)一系列基于細(xì)胞的檢測(cè)方法，例如抗體依賴性細(xì)胞毒性（ADCC）或細(xì)胞毒性（CDC）檢測(cè)，以測(cè)試ADC的各種作用機(jī)制，尤其是在單克隆抗體被證實(shí)具有治療作用的情況下，必須確定將該抗體與細(xì)胞毒素連接不會(huì)改變或消除其治療作用機(jī)制。

評(píng)估細(xì)胞內(nèi)MMAE激活導(dǎo)致細(xì)胞凋亡
評(píng)估特定抗體偶聯(lián)藥物（ADC）及其靶細(xì)胞類型的相關(guān)文獻(xiàn)，不僅是明確其多重作用機(jī)制的必要途徑，更為測(cè)定方法開發(fā)初期的起始條件設(shè)定提供了重要依據(jù)。

開發(fā)細(xì)胞檢測(cè)方法時(shí)，需要克服的一個(gè)重要挑戰(zhàn)是生物學(xué)變異。細(xì)胞系之間的變異來源包括細(xì)胞倍增時(shí)間、細(xì)胞表面抗原密度、毒素敏感性和接種密度。因此，在開發(fā)新的檢測(cè)方法時(shí)，優(yōu)化孵育時(shí)間、細(xì)胞暴露于藥物的時(shí)間、細(xì)胞密度以及藥物濃度范圍至關(guān)重要。明確定義最終效力曲線的特征也至關(guān)重要。表1列出了方法開發(fā)所需效價(jià)曲線的特征，主要表現(xiàn)為3個(gè)特征：

1）數(shù)據(jù)點(diǎn)本身必須定義一條曲線，該曲線具有四個(gè)參數(shù)，分別為上漸近線、下漸近線、線性部分以及易于定義的EC50至少應(yīng)有三個(gè)點(diǎn)；

2）上下漸近線之間的倍數(shù)響應(yīng)差異，應(yīng)該能夠用四參數(shù)邏輯模型擬合數(shù)據(jù)，且R平方值大于 0.95，表明原始數(shù)據(jù)與模型擬合良好；

3）為了確保樣品和參比物與細(xì)胞的相互作用方式相同，各自效價(jià)曲線的線性部分必須平行，這種平行性可通過目測(cè)和曲線的統(tǒng)計(jì)分析來驗(yàn)證。影響這些特征的檢測(cè)參數(shù)主要有藥物濃度系列、藥物孵育時(shí)間和細(xì)胞接種密度。

表1 所需效價(jià)曲線的特征

圖2顯示在初始細(xì)胞密度和孵育時(shí)間固定的情況下，對(duì)細(xì)胞加入不同藥物濃度系列的試驗(yàn)結(jié)果。該試驗(yàn)證明了想要開發(fā)的檢測(cè)方法是可行的。此外，該實(shí)驗(yàn)還確定了適用于后續(xù)開發(fā)步驟的合適藥物濃度系列。圖中曲線呈現(xiàn)出良好的 S 形，具有相當(dāng)清晰的上漸近線、線性區(qū)域和下漸近線。

圖3顯示了不同孵育時(shí)間和細(xì)胞密度的影響。左圖和右圖分別是孵育5天和6天，不同細(xì)胞密度、相同藥物濃度的結(jié)果；與孵育5天相比，孵育6天后效力曲線的質(zhì)量有所下降。

原因可能是因?yàn)榉跤?天有大量細(xì)胞死亡，導(dǎo)致難以在檢測(cè)中區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞。所以，確定孵育5天被認(rèn)為是獲得高質(zhì)量效力曲線的最佳時(shí)間。

對(duì)孵育5天時(shí)間的曲線進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以確定哪條曲線質(zhì)量最佳。接下來重點(diǎn)關(guān)注每條曲線的R平方值，以確定哪條曲線最能擬合相應(yīng)的數(shù)據(jù)。

對(duì)5天培養(yǎng)曲線的分析，紅色曲線展現(xiàn)出最佳的R²值，R²值最接近于1，且AD比值最高。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步優(yōu)化了濃度系列和細(xì)胞密度，最終生成了用于預(yù)驗(yàn)證的最終檢測(cè)方法。

在報(bào)告結(jié)果時(shí)未對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行絕對(duì)效價(jià)值報(bào)，而是每次測(cè)定中都會(huì)加入一個(gè)參考品，以相對(duì)效價(jià)作為報(bào)告結(jié)果。

圖4藍(lán)色為參考品、紫色為對(duì)照樣品，對(duì)照樣品與參考品曲線完全重合，根據(jù)曲線的偏倚情況可以看出左圖中低DAR值樣品與右圖的高DAR樣品相比，高DAR值樣品具有較高的活性值。

區(qū)分高DAR和低DAR樣品是ADC效力測(cè)定中的另一個(gè)重要指標(biāo)，因?yàn)锳DC的作用機(jī)制是內(nèi)化和隨后的毒素釋放，如果檢測(cè)方法對(duì)DAR不敏感，則ADC未能殺死細(xì)胞的機(jī)制以及該檢測(cè)方法是否適合作為體內(nèi)藥物活性的模型都會(huì)受到質(zhì)疑。

細(xì)胞活性分析方法驗(yàn)證
方法驗(yàn)證按照ICH指南進(jìn)行，圖5顯示了該檢測(cè)方法的線性度和范圍結(jié)果，其線性度與標(biāo)稱值之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著相關(guān)性，相對(duì)效價(jià)均在50%～200%之間（相對(duì)值）。

表2為方法驗(yàn)證的驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果顯示所有數(shù)據(jù)點(diǎn)的準(zhǔn)確度和精密度均在50%～200%之間，通過了驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)，判定該檢測(cè)方法的有效范圍為50%～200%。

評(píng)估的準(zhǔn)確性是通過計(jì)算相對(duì)偏差來確定的，相對(duì)偏差是將特定評(píng)估的名義效力與觀察到的效力進(jìn)行比較。

評(píng)估測(cè)定中最大的相對(duì)偏差百分比為3.3%。觀察到評(píng)估結(jié)果為141%，比預(yù)期高3.3%。

重復(fù)性是通過測(cè)量在同一次運(yùn)行中進(jìn)行的6次100%評(píng)估的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)來確定的，結(jié)果為3.9%；

中間精密度通過四次評(píng)估確定，每次評(píng)估分兩次進(jìn)行，由不同的分析員使用不同批次的胎牛血清作為培養(yǎng)基，并在不同的日期進(jìn)行。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為4.5%；

通過比較使用兩個(gè)不同的細(xì)胞庫進(jìn)行評(píng)估的相對(duì)偏差來確定穩(wěn)健性，最大相對(duì)偏差百分比為5.6%；

結(jié)果表明，考察評(píng)估準(zhǔn)確性、一次運(yùn)行內(nèi)的變異性、運(yùn)行間的變異性以及不同細(xì)胞庫之間的變異性，所有結(jié)果均通過了方法驗(yàn)證的驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)。

系統(tǒng)適用性標(biāo)準(zhǔn)，效價(jià)曲線的r平方值、每種藥物濃度下三個(gè)重復(fù)測(cè)量的精密度、AD 比率以及用于確定相對(duì)效價(jià)的樣品曲線和參考曲線的平行性。這些系統(tǒng)適用性標(biāo)準(zhǔn)符合驗(yàn)證階段設(shè)定的驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)，并隨后被納入樣品測(cè)試的數(shù)據(jù)分析中。使用經(jīng)驗(yàn)證的檢測(cè)方法生成的數(shù)據(jù)必須滿足這些系統(tǒng)適用性標(biāo)準(zhǔn)才能被接受。

圖6通過比較ADC SDE‑100的相對(duì)效力與單克隆抗體 HuMax‑TAC和NAC淬滅毒素連接子vcMMAE的相對(duì)效力，檢測(cè)了該方法的特異性。