基于流式細(xì)胞術(shù)的抗體偶聯(lián)藥物內(nèi)吞作用的機(jī)制、評(píng)估與檢測(cè)方法
一、內(nèi)吞途徑與ADC在腫瘤靶向治療中的作用機(jī)制
以生物機(jī)制為基礎(chǔ)的現(xiàn)代腫瘤治療策略日益關(guān)注靶受體介導(dǎo)的內(nèi)吞與胞吐循環(huán)過(guò)程。然而，在腫瘤發(fā)展進(jìn)程中，受體轉(zhuǎn)運(yùn)通路——包括內(nèi)體分選、溶酶體定位及側(cè)膜遷移等——常呈現(xiàn)功能失調(diào)，進(jìn)而影響藥物遞送效率�？贵w偶聯(lián)藥物（ADC）通過(guò)將特異性靶向抗體與高效細(xì)胞毒性載荷相偶聯(lián)，為提升化療的靶向性提供了新的技術(shù)路徑。
ADC作為一類(lèi)新型靶向抗腫瘤藥物，由三個(gè)核心部分構(gòu)成：特異性識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原的單克隆抗體、高效細(xì)胞毒性分子（亦稱(chēng)載荷藥物）以及連接二者的化學(xué)連接子。其作用機(jī)制主要包括以下步驟：ADC經(jīng)體內(nèi)循環(huán)抵達(dá)腫瘤組織后，抗體部分特異性結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面靶抗原；所形成的抗原-ADC復(fù)合物通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部；隨后在細(xì)胞內(nèi)特定條件下，細(xì)胞毒性載荷經(jīng)連接子斷裂機(jī)制釋放，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的高選擇性殺傷，同時(shí)顯著降低對(duì)正常組織的系統(tǒng)毒性。
該設(shè)計(jì)策略充分利用了受體介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞毒性藥物的精準(zhǔn)胞內(nèi)遞送，為克服傳統(tǒng)化療藥物靶向性不足、毒副作用較大等局限提供了重要解決方案。
二、ADC靶點(diǎn)篩選與內(nèi)吞效率評(píng)估方法概述
選擇合適的靶抗原是開(kāi)發(fā)高效抗體偶聯(lián)藥物（ADC）的重要基礎(chǔ)。理想的藥物靶點(diǎn)需在腫瘤細(xì)胞表面顯著過(guò)表達(dá)，以確保藥物的特異性識(shí)別與結(jié)合。同時(shí)，靶抗原介導(dǎo)的內(nèi)吞效率是ADC發(fā)揮治療作用的關(guān)鍵因素之一，直接影響藥物能否有效進(jìn)入細(xì)胞并釋放活性載荷，因而成為ADC體內(nèi)藥效實(shí)現(xiàn)的關(guān)鍵初始環(huán)節(jié)。
目前，常用于評(píng)估ADC內(nèi)吞效率的實(shí)驗(yàn)方法主要包括流式細(xì)胞術(shù)、共聚焦顯微鏡細(xì)胞內(nèi)定位技術(shù)及熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）技術(shù)等。以下表格系統(tǒng)比較了不同方法的核心原理及其主要優(yōu)勢(shì)與局限性，為相關(guān)研究方法選擇提供參考。
三、基于流式細(xì)胞術(shù)的ADC內(nèi)吞效率間接檢測(cè)方法
流式細(xì)胞術(shù)間接檢測(cè)法是一種經(jīng)濟(jì)、高通量的ADC內(nèi)吞效率常規(guī)評(píng)估策略。該方法主要依據(jù)細(xì)胞表面結(jié)合的ADC分子數(shù)量減少情況，間接反映其被細(xì)胞內(nèi)吞的效率。
具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如下：將ADC與細(xì)胞分別在4℃（內(nèi)吞抑制）和37℃（內(nèi)吞允許）條件下孵育。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩組細(xì)胞在特定時(shí)間點(diǎn)的平均熒光強(qiáng)度（MFI），以4℃組作為參照基準(zhǔn)。內(nèi)吞效率可根據(jù)37℃組MFI相對(duì)于4℃組MFI的下降百分比進(jìn)行計(jì)算。該方法為ADC內(nèi)吞動(dòng)力學(xué)的定量評(píng)價(jià)提供了標(biāo)準(zhǔn)化、可重復(fù)的實(shí)驗(yàn)手段。
四、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ADC內(nèi)吞效率標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)流程
基于流式細(xì)胞術(shù)間接法檢測(cè)ADC內(nèi)吞效率的實(shí)驗(yàn)操作步驟如下：
1.細(xì)胞處理與一抗孵育：收集目標(biāo)細(xì)胞，以每孔1×10⁵個(gè)細(xì)胞的密度接種至96孔U型板中，加入待測(cè)ADC抗體，于4℃避光孵育30分鐘。
2.洗滌與內(nèi)吞誘導(dǎo)：使用完全培養(yǎng)基洗滌去除未結(jié)合抗體，重懸細(xì)胞后轉(zhuǎn)移至37℃、5% CO₂培養(yǎng)箱中孵育，并設(shè)置多個(gè)時(shí)間點(diǎn)（如0、15、30、60、120分鐘）以進(jìn)行動(dòng)力學(xué)觀測(cè)。
3.二抗標(biāo)記：在各時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，離心去上清，加入預(yù)冷FACS緩沖液配制的熒光標(biāo)記二抗（如PE標(biāo)記的羊抗人IgG Fc），4℃避光孵育30分鐘。
4.洗滌與上機(jī)檢測(cè)：經(jīng)FACS緩沖液洗滌后，以100 μL相同緩沖體重懸細(xì)胞，過(guò)濾后上機(jī)進(jìn)行流式檢測(cè)。
該流程通過(guò)溫控孵育與時(shí)間點(diǎn)采樣，結(jié)合表面殘留抗體的熒光標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)了ADC內(nèi)吞過(guò)程的定量化與時(shí)序化分析。
五、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析與結(jié)論
本研究應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)，在HEK293細(xì)胞模型中對(duì)三種抗體（2B9、2B12及1H9）在scFv單體與scFv–phage兩種形式下的內(nèi)化能力進(jìn)行了系統(tǒng)比較。根據(jù)內(nèi)化效率公式計(jì)算結(jié)果顯示：2B9與2B12在兩種結(jié)構(gòu)形式下均表現(xiàn)出顯著的內(nèi)化活性；而1H9的scFv形式內(nèi)化效率較低（＜10%），其scFv–phage形式幾乎未見(jiàn)內(nèi)化。
六、研究總結(jié)與展望
深入研究靶標(biāo)受體的內(nèi)吞機(jī)制及ADC的內(nèi)化特性，對(duì)于推動(dòng)其臨床前開(kāi)發(fā)、臨床轉(zhuǎn)化及提升患者治療效果具有重要意義。本研究所采用的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)方法在抗體內(nèi)化能力評(píng)估中具有以下突出優(yōu)點(diǎn)：
操作流程標(biāo)準(zhǔn)化，易于實(shí)施與重復(fù)；
支持終點(diǎn)式檢測(cè)，可準(zhǔn)確反映特定時(shí)間點(diǎn)的內(nèi)化水平；
成本效益較高，常用熒光二抗（如PE/APC）價(jià)格相對(duì)經(jīng)濟(jì)；
具備高通量分析能力，支持多樣本并行處理與相對(duì)定量比較。
該方法的建立與優(yōu)化，為抗體及ADC藥物的早期篩選、機(jī)制研究與效能評(píng)估提供了穩(wěn)定、高效的技術(shù)平臺(tái)，有助于促進(jìn)該類(lèi)藥物的研發(fā)進(jìn)程與臨床轉(zhuǎn)化。
七、流式細(xì)胞術(shù)FMC服務(wù)哪里有？
LabEx為您提供專(zhuān)業(yè)、高效的全套流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry, FMC）服務(wù)。我們配備多臺(tái)高性能流式細(xì)胞分析儀與分選儀，可對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行高速、多參數(shù)的定量分析與分選。
| 貨號(hào) | Panel名稱(chēng) | 種屬 | 檢測(cè)指標(biāo) |
| LXRFM07-4 | 小鼠TH17/Treg 7色Panel | Mouse | CD45；CD3；CD4；IL-17A；CD25；FOXP3；L/D |
| LXRFM05-3 | 小鼠T cell 5色panel | Mouse | CD45；CD3；CD4；CD8；L/D |
| LXFM08-1 | 小鼠Th1/Th2/Th17細(xì)胞8色Panel | Mouse | L/D,IFN-γ,CD4,CD8,IL-4,IL-17A,CD45,CD3 |
| LXFM09-1 | 小鼠Th1/Th2/Th17+Treg細(xì)胞9色Panel | Mouse | L/D,IFN-γ,IL-4,IL-17A,CD4,CD45,CD3,CD25,Foxp3 |
樂(lè)備實(shí)（上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司旗下全資子公司），是國(guó)內(nèi)專(zhuān)注于提供高質(zhì)量蛋白檢測(cè)以及組學(xué)分析服務(wù)的實(shí)驗(yàn)服務(wù)專(zhuān)家，自2018年成立以來(lái)，樂(lè)備實(shí)不斷尋求突破，公司的服務(wù)技術(shù)平臺(tái)已擴(kuò)展到單細(xì)胞測(cè)序、空間多組學(xué)、流式檢測(cè)、超敏電化學(xué)發(fā)光、Luminex多因子檢測(cè)、抗體芯片、PCR Array、ELISA、Elispot、PLA蛋白互作、多色免疫組化、DSP空間多組學(xué)等30多個(gè)，建立起了一套涵蓋基因、蛋白、細(xì)胞以及組織水平實(shí)驗(yàn)的完整檢測(cè)體系。
原文點(diǎn)擊：基于流式細(xì)胞術(shù)的抗體偶聯(lián)藥物內(nèi)吞作用研究：機(jī)制、方法與評(píng)估
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