脂質(zhì)納米粒(LNP)遞送mRNA的機制及轉(zhuǎn)染實驗步驟
背景介紹
裸露的RNA是帶負電荷的親水性大分子，因為細胞膜的靜電排斥，難以進入細胞，且易被無處不在的RNA酶快速降解，所以需要保護性外殼才能進入細胞。細胞膜的組成主要是脂質(zhì)，利用脂質(zhì)囊泡包封RNA穿過細胞膜并將RNA釋放到細胞質(zhì)中。囊泡應(yīng)該是一種帶正電的脂質(zhì)，才能夠結(jié)合帶負電的RNA。
然而，由永久性陽離子脂質(zhì)組成的囊泡由于能與帶負電的細胞膜發(fā)生靜電作用而引起細胞毒性，脂質(zhì)結(jié)構(gòu)才能夠?qū)?nèi)體酸性環(huán)境響應(yīng)而帶正電荷的分子。
脂質(zhì)納米粒結(jié)構(gòu)
LNP通常由四種關(guān)鍵成分組成：可離子化的陽離子脂質(zhì)、磷脂（兩性離子脂質(zhì)）(PL)、膽固醇和PEG化脂質(zhì)。
脂質(zhì)納米粒遞送機制
脂質(zhì)納米粒(LNP)作為mRNA的傳遞系統(tǒng)，其作用機制涉及多個步驟，確保mRNA安全有效地遞送到目標細胞并表達蛋白。在LNP中，可電離的陽離子脂質(zhì)發(fā)揮著重要作用，因為它可以帶正電荷低于其Ka以介導(dǎo)在自組裝成LNP期間負載帶負電荷的RNA，在中性pH下不帶電以最大限度地減少毒性，并在細胞吸收后再次帶正電荷以促進內(nèi)體逃逸隨著內(nèi)體pH降低。膽固醇和PEG脂質(zhì)的變體已被證明可以調(diào)節(jié)LNP物理性質(zhì)、納米結(jié)構(gòu)和最終功效。兩性離子磷脂通常被稱為“輔助脂質(zhì)”。LNPs在保護mRNA、促進細胞內(nèi)傳遞、以及激活免疫反應(yīng)方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。
LNP轉(zhuǎn)染實驗步驟
下述轉(zhuǎn)染步驟中為6孔板單孔參考條件。對于其他培養(yǎng)形式，請參考表1。
將2.5ug mRNA（濃度為1ug/uL）與60uL Buffer混合。
2、mRNA-easyLNP復(fù)合物
將62.5uL mRNA預(yù)混液與62.5uL easyLNP納米混懸液混合，渦旋2-3s，混勻。
3、加入細胞
將125uL mRNA-easyLNP復(fù)合物加入細胞，輕輕晃動使均勻分散。
4、分析時間
培養(yǎng)24-48h后分析。
表1 根據(jù)每孔使用的細胞培養(yǎng)容器的mRNA轉(zhuǎn)染指南
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mRNA細胞轉(zhuǎn)染步驟 |
試劑 |
96孔板 |
24孔板 |
6孔板 |
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（1）40ng/μL mRNA預(yù)混液制備 |
Buffer(以mRNA原液濃度1μg/μL為例) |
2.4μL |
12μL |
60μL |
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mRNA |
0.1μg |
0.5μg |
2.5μg |
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（2）mRNA-easyLNP復(fù)合物制備 |
easyLNP納米混懸液 |
2.5μL |
12.5μL |
62.5μL |
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mRNA預(yù)混液 |
2.5μL |
12.5μL |
62.5μL |
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（3）加入細胞 |
mRNA-easyLNP復(fù)合物 |
5μL |
25μL |
125μL |
實驗示意圖：
產(chǎn)品推薦：
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轉(zhuǎn)染方式 |
貨號 |
品名 |
規(guī)格 |
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細胞 |
mRNA轉(zhuǎn)染試劑 |
1mL |
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easyLNP™ mRNA免疫細胞轉(zhuǎn)染試劑盒 |
1.5mL/3mL/5mL |
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easyLNP™ Plus通用型RNA細胞轉(zhuǎn)染試劑盒 |
1.5mL/3mL/5mL |
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Lipofect5000質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑 |
0.5mL/1.0mL |
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質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染試劑盒(貼壁細胞) |
0.5mL/1.0mL/1.5mL |
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PM原代細胞質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染試劑盒 |
0.1mL/0.5mL/1.0mL/1.5mL |
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SP懸浮細胞質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染試劑盒 |
0.1mL/0.5mL/1.0mL/1.5mL |
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RF 293細胞DNA轉(zhuǎn)染試劑盒 |
0.5mL/1.5mL |
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核酸轉(zhuǎn)染試劑盒 |
0.5mL/1.0mL/1.5mL |
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PM原代細胞核酸轉(zhuǎn)染試劑盒 |
0.5mL/1.0mL/1.5mL |
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SP懸浮細胞核酸轉(zhuǎn)染試劑盒 |
0.5mL/1.0mL/1.5mL |
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小核酸轉(zhuǎn)染試劑 |
0.5mL/1.0mL/1.5mL |
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PM原代細胞小核酸轉(zhuǎn)染試劑 |
0.1mL/0.5mL/1.0mL/1.5mL |
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SP懸浮細胞小核酸轉(zhuǎn)染試劑 |
0.1mL/0.5mL/1.0mL/1.5mL |
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核酸共轉(zhuǎn)染試劑 |
0.5mL/1.0mL/1.5mL |
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50nm磁轉(zhuǎn)染試劑 |
100uL |
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轉(zhuǎn)染增強劑 |
聚凝胺溶液 |
1mL |
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海美溴銨 |
5g |
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魚精蛋白硫酸鹽 |
5g/25g |
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動物體內(nèi) |
easyLNP™ mRNA體內(nèi)轉(zhuǎn)染試劑盒(全身作用) |
0.3mL/0.5mL/1mL |
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easyLNP™ mRNA體內(nèi)轉(zhuǎn)染試劑盒(局部作用) |
0.3mL/0.5mL/1mL |
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核酸轉(zhuǎn)染(動物體內(nèi)) |
Elite Fect-I小核酸活體組織轉(zhuǎn)染試劑(小鼠轉(zhuǎn)染) |
3只/6只 |
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