Pipetty電動移液器在狂犬病毒檢測（實時熒光RT-PCR）中的應(yīng)用
方案摘要：本方案以 Pipetty 電動移液器為核心移液工具，優(yōu)化狂犬病毒實時熒光 RT-PCR 檢測流程。其 75g 超輕機身適配筆式操作，便于在 RNA 提取時精準(zhǔn)移取 0.1-20μL 微量洗脫液，提升核酸回收率。在 RT-PCR 體系配制環(huán)節(jié)，依托其高精度連續(xù)分液功能，可快速等量分配引物、探針等試劑，操作效率較手動提升 50% 以上。更通過專利溫度控制技術(shù)，實時補償手熱導(dǎo)致的移液偏差，避免體系誤差影響 Ct 值判讀。適配多品牌吸頭的特性可降低耗材費用，并全程減少人為操作差異，為病毒檢測的高敏感性與特異性提供可靠支撐。
方案詳情：
一、實驗原理
狂犬病毒為單鏈負(fù)鏈 RNA 病毒，無法直接用 PCR 擴增，故需先經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄（RT）步驟：以病毒 RNA 為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成可擴增的互補 DNA（cDNA）。后續(xù)通過實時熒光定量 PCR實現(xiàn)檢測：向反應(yīng)體系中加入針對狂犬病毒保守基因（如核蛋白 N 基因，序列穩(wěn)定、特異性高）的引物與熒光探針。PCR 循環(huán)中，引物特異性結(jié)合 cDNA 并引導(dǎo)其擴增，同時熒光探針隨擴增被水解，釋放熒光信號。儀器實時監(jiān)測熒光強度，當(dāng)信號達(dá)到設(shè)定閾值時，記錄對應(yīng)的循環(huán)數(shù)（Ct 值）。通常 Ct 值＜臨界值（如 37）且熒光曲線呈 “S” 型為陽性（提示存在病毒 RNA），Ct 值≥臨界值或無熒光信號為陰性，以此實現(xiàn)病毒的快速、敏感檢測。
二、實驗準(zhǔn)備
1、設(shè)配和材料
① Pipetty電動移液器MSIC01-03-20，MSIC01-03-250，MSIC01-03-1000；
② A2 型生物安全柜；
③ 小型臺式冷凍離心機；
④ 熒光定量PCR 儀；
2、試劑和材料
① 狂大病病毒陽性對照腦組織；
② 狂大病病毒陰性對照腦組織；
③ 特異性擴增引物和探針：
上游引物F:5’-CCCTACAATGGATGCCGAC;
下游引物R:5’-AGCTTGGCAGCATTCATRCC;
熒光探針P:FAM-AGTCAATAATCAGGTGGTCTC-TAMRA。
④ RNA 提取試劑盒或試劑(商品化試劑)；
⑤ 一步法實時熒光RT-PCR 試劑盒或相應(yīng)酶類及緩沖液(商品化試劑,包括反轉(zhuǎn)錄酶、DNA 聚合酶dNTP、反應(yīng)緩沖液、無 RNA 酶水等）；
三、實驗步驟
1、分別從不同部位待檢腦組織(至少應(yīng)包含腦干及小腦組織)各取樣品約1g，樣品量少時可取全部組織。剪碎混勻,取其中約1g置組織勻漿器中,加入1mL生理鹽水進(jìn)行勻漿,以3000g離心2min 后取 100μL,勻漿上清于 1.5 mL滅菌離心管中。使用Pipetty電動移液器，將狂犬病病毒陽性和陰性對照腦組織各取 100μL分別置于 1.5 mL 滅菌離心管中。唾液樣品直接取 100μL, 置于 1.5 mL滅菌離心管中。
2、使用Pipetty電動移液器，使用 RNA 提取試劑盒,按試劑盒說明書提取待檢樣品和對照樣品總 RNA。
3、用無 RNA 酶水將引物溶解或稀釋至濃度 10 μmol/L。
4、使用一步法實時熒光 RT-PCR 試劑盒,按說明書配制 50 μL,反應(yīng)體系,設(shè)置Pipetty電動移液器的連續(xù)分液程序，精準(zhǔn)加入經(jīng)稀釋的上游引物 F、下游引物 R各 1.5 μL,探針P 1μL,提取的樣品總 RNA 5μL,混勻后瞬時離心,置熒光定量 PCR 儀內(nèi)進(jìn)行擴增。
5、45 ℃反轉(zhuǎn)錄 20 min;95 ℃預(yù)變性2 min;95 ℃變性 15 s,56 ℃退火 15 s,72 ℃延伸 20 s,或95 ℃變性 15 s,60 ℃退火和延伸 30 s,40 個擴增循環(huán)。設(shè)定于延伸反應(yīng)末收集 FAM 熒光信號。
四、結(jié)果判定
1、狂犬病病毒陽性對照樣品 Ct<33、陰性對照樣品無 Ct或 Ct>37 時,檢測有效。
2、待檢樣品 Ct≤33 時,判定為狂犬病病毒核酸陽性;無 Ct或 Ct>37 時,判定為狂犬病病毒核酸陰性。
3、待檢樣品 33
方案詳情：
一、實驗原理
狂犬病毒為單鏈負(fù)鏈 RNA 病毒，無法直接用 PCR 擴增，故需先經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄（RT）步驟：以病毒 RNA 為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成可擴增的互補 DNA（cDNA）。后續(xù)通過實時熒光定量 PCR實現(xiàn)檢測：向反應(yīng)體系中加入針對狂犬病毒保守基因（如核蛋白 N 基因，序列穩(wěn)定、特異性高）的引物與熒光探針。PCR 循環(huán)中，引物特異性結(jié)合 cDNA 并引導(dǎo)其擴增，同時熒光探針隨擴增被水解，釋放熒光信號。儀器實時監(jiān)測熒光強度，當(dāng)信號達(dá)到設(shè)定閾值時，記錄對應(yīng)的循環(huán)數(shù)（Ct 值）。通常 Ct 值＜臨界值（如 37）且熒光曲線呈 “S” 型為陽性（提示存在病毒 RNA），Ct 值≥臨界值或無熒光信號為陰性，以此實現(xiàn)病毒的快速、敏感檢測。
二、實驗準(zhǔn)備
1、設(shè)配和材料
① Pipetty電動移液器MSIC01-03-20，MSIC01-03-250，MSIC01-03-1000；
② A2 型生物安全柜；
③ 小型臺式冷凍離心機；
④ 熒光定量PCR 儀；
2、試劑和材料
① 狂大病病毒陽性對照腦組織；
② 狂大病病毒陰性對照腦組織；
③ 特異性擴增引物和探針：
上游引物F:5’-CCCTACAATGGATGCCGAC;
下游引物R:5’-AGCTTGGCAGCATTCATRCC;
熒光探針P:FAM-AGTCAATAATCAGGTGGTCTC-TAMRA。
④ RNA 提取試劑盒或試劑(商品化試劑)；
⑤ 一步法實時熒光RT-PCR 試劑盒或相應(yīng)酶類及緩沖液(商品化試劑,包括反轉(zhuǎn)錄酶、DNA 聚合酶dNTP、反應(yīng)緩沖液、無 RNA 酶水等）；
三、實驗步驟
1、分別從不同部位待檢腦組織(至少應(yīng)包含腦干及小腦組織)各取樣品約1g，樣品量少時可取全部組織。剪碎混勻,取其中約1g置組織勻漿器中,加入1mL生理鹽水進(jìn)行勻漿,以3000g離心2min 后取 100μL,勻漿上清于 1.5 mL滅菌離心管中。使用Pipetty電動移液器，將狂犬病病毒陽性和陰性對照腦組織各取 100μL分別置于 1.5 mL 滅菌離心管中。唾液樣品直接取 100μL, 置于 1.5 mL滅菌離心管中。
2、使用Pipetty電動移液器，使用 RNA 提取試劑盒,按試劑盒說明書提取待檢樣品和對照樣品總 RNA。
3、用無 RNA 酶水將引物溶解或稀釋至濃度 10 μmol/L。
4、使用一步法實時熒光 RT-PCR 試劑盒,按說明書配制 50 μL,反應(yīng)體系,設(shè)置Pipetty電動移液器的連續(xù)分液程序，精準(zhǔn)加入經(jīng)稀釋的上游引物 F、下游引物 R各 1.5 μL,探針P 1μL,提取的樣品總 RNA 5μL,混勻后瞬時離心,置熒光定量 PCR 儀內(nèi)進(jìn)行擴增。
5、45 ℃反轉(zhuǎn)錄 20 min;95 ℃預(yù)變性2 min;95 ℃變性 15 s,56 ℃退火 15 s,72 ℃延伸 20 s,或95 ℃變性 15 s,60 ℃退火和延伸 30 s,40 個擴增循環(huán)。設(shè)定于延伸反應(yīng)末收集 FAM 熒光信號。
四、結(jié)果判定
1、狂犬病病毒陽性對照樣品 Ct<33、陰性對照樣品無 Ct或 Ct>37 時,檢測有效。
2、待檢樣品 Ct≤33 時,判定為狂犬病病毒核酸陽性;無 Ct或 Ct>37 時,判定為狂犬病病毒核酸陰性。
3、待檢樣品 33
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