mTOR的信號(hào)通路及WB檢測(cè)和磷酸化時(shí)常見問題及解決方法
mTOR
mTOR全稱為哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin），是PI3K相關(guān)激酶家族中的一種絲氨酸蛋白激酶。在真核細(xì)胞中，mTOR可以通過感知和整合生長因子、能量狀態(tài)和營養(yǎng)水平等外部信息，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長發(fā)育和細(xì)胞自噬等重要生命過程[1]。mTOR信號(hào)通路的功能障礙可以引起多種疾病，包括肥胖和糖尿病，甚至腫瘤[2]。mTOR信號(hào)通路是一個(gè)非常經(jīng)典的熱門靶點(diǎn)，那么今天小優(yōu)細(xì)節(jié)君就帶大家一起了解一下這個(gè)蛋白。
mTOR可以形成兩種不同的復(fù)合物mTORC1和mTORC2，來行使不同的功能[3]。mTORC1和mTORC2的差異請(qǐng)見下圖：
mTORC1主要響應(yīng)營養(yǎng)、能量和生長因子等信號(hào)，通過磷酸化下游效應(yīng)子來促進(jìn)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核苷酸和葡萄糖的合成，抑制蛋白質(zhì)的分解。主要下游效應(yīng)子有S6K1、4E-BP1、ULK1，還有多種轉(zhuǎn)錄因子，從而發(fā)揮不同的功能。
mTORC2主要充當(dāng)胰島素/PI3K信號(hào)通路的效應(yīng)子，功能雖少，但是非常重要。同時(shí)也受mTORC1的負(fù)反饋回路調(diào)節(jié)[5]。
如果各位小伙伴不知道要研究下游哪個(gè)蛋白，可以參考下圖。
通過前面的介紹，相信大家對(duì)mTOR的結(jié)構(gòu)和功能有一定的了解，接下來小優(yōu)細(xì)節(jié)君就和大家一起探討一下關(guān)于WB檢測(cè)中mTOR和磷酸化mTOR經(jīng)常遇見無信號(hào)的情況，該如何解決。
01 首先需要了解所使用樣本的表達(dá)量情況。
雖然說mTOR是個(gè)生長和代謝重要的蛋白，幾乎在所有組織中都有表達(dá)，但是組織間也是有明顯高低差異的，如果忽略了這點(diǎn)，可能就會(huì)出現(xiàn)無條帶或者弱條帶的情況。我們可以通過查閱數(shù)據(jù)庫如The Human Protein Altas，BioGPS，Depmap等去查看樣本表達(dá)的高低。如下圖，脂肪組織，平滑肌組織，淋巴結(jié)組織就未檢測(cè)到蛋白表達(dá)。
如果樣本表達(dá)較少可以通過增加上樣量，組織樣本上樣50ug以上，細(xì)胞樣本上樣20ug以上，加上充分裂解樣本（超聲處理）。同時(shí)也可以通過增加陽性對(duì)照樣本來排查問題。
Tips：樣本如何超聲，使用超聲頻率是30%-40%的超聲儀，冰浴超聲5s*3次; 如果沒有超聲儀，可以用1ml 帶針頭注的射器冰上反復(fù)抽吸至無阻力。
02 排除WB實(shí)驗(yàn)步驟問題，尤其是轉(zhuǎn)膜步驟。
由于mTOR蛋白分子量達(dá)到289KDa，大分子量WB從來不是一件容易的事情，我們需要額外注意一些細(xì)節(jié)：
❖Marker：更換大分子量marker，方便判斷條帶位置。
❖電泳：是否選擇合適的膠，電泳時(shí)間是否足夠蛋白跑下來。我們建議使用6%的膠，電泳時(shí)間延長至1.5-2h。
❖轉(zhuǎn)膜：轉(zhuǎn)膜液甲醇濃度，轉(zhuǎn)膜電流，時(shí)間和溫度是否合適。我們推薦降低轉(zhuǎn)膜液中的甲醇濃度，5-10%，可以額外添加0.1%SDS幫助蛋白轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)膜選擇恒流轉(zhuǎn)，200-250mA，時(shí)間3-4h，轉(zhuǎn)膜期間務(wù)必保持低溫。
03 如果total mTOR沒問題，p-mTOR無條帶，我們還需要判斷對(duì)樣本的刺激方式是否合適，是否成功誘導(dǎo)磷酸化。
1) 從PSP數(shù)據(jù)庫中，我們可以查到常用的刺激物是什么。括號(hào)里的數(shù)字為參考文獻(xiàn)，可以點(diǎn)擊具體查看。
如果刺激物沒問題，我們還需要進(jìn)一步做一下濃度和時(shí)間的梯度，來確定最佳的實(shí)驗(yàn)條件。
2) 我們可以參考廠家官網(wǎng)上查看質(zhì)檢所用的樣本是如何刺激處理的。
3) 制樣時(shí)必須加入磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑，防止磷酸化蛋白降解。也可以檢測(cè)相關(guān)的上下游磷酸化蛋白以佐證實(shí)驗(yàn)步驟正常。
部分推薦產(chǎn)品助力您的實(shí)驗(yàn)：
mTOR全稱為哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin），是PI3K相關(guān)激酶家族中的一種絲氨酸蛋白激酶。在真核細(xì)胞中，mTOR可以通過感知和整合生長因子、能量狀態(tài)和營養(yǎng)水平等外部信息，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長發(fā)育和細(xì)胞自噬等重要生命過程[1]。mTOR信號(hào)通路的功能障礙可以引起多種疾病，包括肥胖和糖尿病，甚至腫瘤[2]。mTOR信號(hào)通路是一個(gè)非常經(jīng)典的熱門靶點(diǎn)，那么今天小優(yōu)細(xì)節(jié)君就帶大家一起了解一下這個(gè)蛋白。
mTOR可以形成兩種不同的復(fù)合物mTORC1和mTORC2，來行使不同的功能[3]。mTORC1和mTORC2的差異請(qǐng)見下圖：
圖1 mTORC1和mTORC2的區(qū)別
mTORC1主要響應(yīng)營養(yǎng)、能量和生長因子等信號(hào)，通過磷酸化下游效應(yīng)子來促進(jìn)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核苷酸和葡萄糖的合成，抑制蛋白質(zhì)的分解。主要下游效應(yīng)子有S6K1、4E-BP1、ULK1，還有多種轉(zhuǎn)錄因子，從而發(fā)揮不同的功能。
mTORC2主要充當(dāng)胰島素/PI3K信號(hào)通路的效應(yīng)子，功能雖少，但是非常重要。同時(shí)也受mTORC1的負(fù)反饋回路調(diào)節(jié)[5]。
如果各位小伙伴不知道要研究下游哪個(gè)蛋白，可以參考下圖。
圖2 mTOR信號(hào)通路
通過前面的介紹，相信大家對(duì)mTOR的結(jié)構(gòu)和功能有一定的了解，接下來小優(yōu)細(xì)節(jié)君就和大家一起探討一下關(guān)于WB檢測(cè)中mTOR和磷酸化mTOR經(jīng)常遇見無信號(hào)的情況，該如何解決。
01 首先需要了解所使用樣本的表達(dá)量情況。
雖然說mTOR是個(gè)生長和代謝重要的蛋白，幾乎在所有組織中都有表達(dá)，但是組織間也是有明顯高低差異的，如果忽略了這點(diǎn)，可能就會(huì)出現(xiàn)無條帶或者弱條帶的情況。我們可以通過查閱數(shù)據(jù)庫如The Human Protein Altas，BioGPS，Depmap等去查看樣本表達(dá)的高低。如下圖，脂肪組織，平滑肌組織，淋巴結(jié)組織就未檢測(cè)到蛋白表達(dá)。
圖3 HPA各組織中mTOR的表達(dá)水平
如果樣本表達(dá)較少可以通過增加上樣量，組織樣本上樣50ug以上，細(xì)胞樣本上樣20ug以上，加上充分裂解樣本（超聲處理）。同時(shí)也可以通過增加陽性對(duì)照樣本來排查問題。
Tips：樣本如何超聲，使用超聲頻率是30%-40%的超聲儀，冰浴超聲5s*3次; 如果沒有超聲儀，可以用1ml 帶針頭注的射器冰上反復(fù)抽吸至無阻力。
02 排除WB實(shí)驗(yàn)步驟問題，尤其是轉(zhuǎn)膜步驟。
由于mTOR蛋白分子量達(dá)到289KDa，大分子量WB從來不是一件容易的事情，我們需要額外注意一些細(xì)節(jié)：
❖Marker：更換大分子量marker，方便判斷條帶位置。
❖電泳：是否選擇合適的膠，電泳時(shí)間是否足夠蛋白跑下來。我們建議使用6%的膠，電泳時(shí)間延長至1.5-2h。
❖轉(zhuǎn)膜：轉(zhuǎn)膜液甲醇濃度，轉(zhuǎn)膜電流，時(shí)間和溫度是否合適。我們推薦降低轉(zhuǎn)膜液中的甲醇濃度，5-10%，可以額外添加0.1%SDS幫助蛋白轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)膜選擇恒流轉(zhuǎn)，200-250mA，時(shí)間3-4h，轉(zhuǎn)膜期間務(wù)必保持低溫。
03 如果total mTOR沒問題，p-mTOR無條帶，我們還需要判斷對(duì)樣本的刺激方式是否合適，是否成功誘導(dǎo)磷酸化。
1) 從PSP數(shù)據(jù)庫中，我們可以查到常用的刺激物是什么。括號(hào)里的數(shù)字為參考文獻(xiàn)，可以點(diǎn)擊具體查看。
圖4 PSP中Ser2448推薦的刺激方式
如果刺激物沒問題，我們還需要進(jìn)一步做一下濃度和時(shí)間的梯度，來確定最佳的實(shí)驗(yàn)條件。
2) 我們可以參考廠家官網(wǎng)上查看質(zhì)檢所用的樣本是如何刺激處理的。
圖5 CST官網(wǎng)上mTOR的刺激方式
3) 制樣時(shí)必須加入磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑，防止磷酸化蛋白降解。也可以檢測(cè)相關(guān)的上下游磷酸化蛋白以佐證實(shí)驗(yàn)步驟正常。
部分推薦產(chǎn)品助力您的實(shí)驗(yàn)：
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產(chǎn)品貨號(hào) |
產(chǎn)品名稱 |
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mTOR Antibody |
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mTOR (7C10) Rabbit mAb |
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Phospho-mTOR (Ser2448) Antibody |
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Phospho-mTOR (Ser2448) (D9C2) XP® Rabbit mAb |
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Phospho-mTOR (Ser2481) Antibody |
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Rabbit anti-mTOR Polyclonal Antibody |
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Rabbit anti-mTOR Polyclonal Antibody |
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Rabbit anti-mTOR Polyclonal Antibody(S2481) |
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Rabbit anti-mTOR Polyclonal Antibody |
參考文獻(xiàn)：
[1] Mardanshahi, A., N.A. Gharibkandi, S. Vaseghi, et al. The PI3K/AKT/mTOR signaling pathway inhibitors enhance radiosensitivity in cancer cell lines[J]. Molecular Biology Reports, 2021, 48(8): p. 1-14.
[2] Harrington LS, et al. The TSC1-2 tumor suppressor controls insulin-PI3K signaling via regulation of IRS proteins. J Cell Biol. 2004;166(2):213–223.
[3] Wang L, Rhodes CJ, Lawrence JC., Jr Activation of mammalian target of rapamycin (mTOR) by insulin is associated with stimulation of 4EBP1 binding to dimeric mTOR complex 1. J Biol Chem. 2006;281:24293–24303.
[4] Saxton RA, Sabatini DM. mTOR signaling in growth, metabolism, and disease. Cell. 2017;168:960–976.
[5] Popova NV, Jücker M. The role of mTOR signaling as a therapeutic target in cancer[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2021, 22(4).
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