Pipetty電動(dòng)移液器在豬藍(lán)耳病毒檢測(cè)（實(shí)時(shí)RT-PCR）中的應(yīng)用
方案摘要：豬繁殖與呼吸綜合征，是由病毒（PRRSV）感染豬引起的一種高度傳染性疫病，臨床表現(xiàn)為母豬繁殖系統(tǒng)障礙，斷奶仔豬消瘦、生長(zhǎng)遲緩以及死亡率增加。該病能引起豬體溫升高、呼吸困難，導(dǎo)致豬耳朵發(fā)紺，又稱藍(lán)耳病，為提升豬藍(lán)耳病毒 實(shí)時(shí)RT-PCR 檢測(cè)效率與準(zhǔn)確性，Pipetty 電動(dòng)移液器憑借核心優(yōu)勢(shì)適配全流程需求，配合溫度補(bǔ)償，可減少手部溫度導(dǎo)致的移液波動(dòng)，保障試劑添加精準(zhǔn)，降低假陰性風(fēng)險(xiǎn)，為豬藍(lán)耳病防控提供可靠支撐。
方案詳情：
一、實(shí)驗(yàn)原理
實(shí)時(shí)RT-PCR 檢測(cè)豬藍(lán)耳�。≒RRS），核心是針對(duì)豬藍(lán)耳病病毒（PRRSV，RNA 病毒）的實(shí)時(shí) RT-PCR 技術(shù)：先通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄將病毒 RNA 轉(zhuǎn)為可擴(kuò)增的 cDNA，再經(jīng) PCR 循環(huán)（變性、退火、延伸）使病毒靶序列指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)；過(guò)程中利用熒光物質(zhì)（如 TaqMan 探針）實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，熒光信號(hào)隨靶序列增加同步增強(qiáng)；最終以熒光達(dá)閾值的循環(huán)數(shù)（Ct 值）判斷 —Ct 值越小病毒量越高，結(jié)合陰 / 陽(yáng)性對(duì)照，實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒的特異定量檢測(cè)。
二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1、設(shè)配和材料
① Pipetty電動(dòng)移液器MSIC01-03-250、MSIC01-02-1000及配套吸頭；
② 熒光PCR 儀；
③ 高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（4 ℃，離心速度 12 000 r/min 以上）；
④ 混勻器；
⑤ 冰箱（2℃~8 ℃、-20 ℃和-70 ℃）；
2、試劑和材料
① 商品化的 RNA 提取裂解液；
② 三氯甲烷；
③ 異丙醇（-20 ℃預(yù)冷）；
④ DEPC 水；
⑤ 75%乙醇；
⑥ dNTPS（含 dATP、dTTP、dCTP、dGTP，各 10 mmol/L）；
⑦ RT-PCR 反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)：AMV或 M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、Taq酶；
⑧ PRRSV-1 實(shí)時(shí) RT-PCR 引物與探針序列
引物與探針序列根據(jù) GenBank 中歐洲株 ORF6/ORF7 保守區(qū)域序列設(shè)計(jì),引物的序列為：
上游引物 P1：5'-CAGATGCAGAYTGTGTTGCCT-3'；
下游引物 P2：5'-TGGAGDCCTGCAGCACTTTC-3'；
探針序列 P3：5'-(FAM)ATACATTCTGGCCCCTGCCCAYCACGT(TAMRA)-3'；
⑨ PRRSV-2 實(shí)時(shí) RT-PCR 引物與探針序列
引物與探針序列根據(jù) GenBank 內(nèi)美洲株 ORF7/3'UTR 保守區(qū)域序列設(shè)計(jì),引物的序列為：
上游引物 P1：5'-GCACTGATTGACAYTGTGCC-3'；
下游引物 P2：5'-CGCATGGTTCTCGCCAAT-3'；
探針序列 P3：5'-(FAM)AGTCACCTATTCAATTAGGGCGACCG(TAMRA)-3'。
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1、樣本總 RNA 的提取
a） 取滅菌的 1.5 mL離心管，基于樣本數(shù)量進(jìn)行編號(hào)。每管加入 600 μL 細(xì)胞裂解液，使用Pipetty電動(dòng)移液器，設(shè)置連續(xù)分液功能，然后分別加入被檢樣本、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、空白對(duì)照（無(wú)核酸酶水）各 200μL，每加完一個(gè)試劑換用一個(gè)吸頭，再各加入 200 μL 三氯甲烷，在混勻器上振蕩混勻5 s。于4 ℃經(jīng) 12 000 r/min 離心 15 min。
b） 取相同數(shù)量滅菌的 1.5 mL離心管，加入 500μL異丙醇。吸取各管中的上清液（至少 500 μL）轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的管中，并顛倒混勻。
c） 于4 ℃經(jīng) 12 000 r/min 離心 15 min，小心倒去上清液，倒置于吸水紙上吸干液體，然后加入600 μL 75%乙醇進(jìn)行洗滌。
d） 于4 ℃、12 000 r/min 離心 10 min，小心倒去上清液，倒置于吸水紙上吸干液體。
e） 64 000 r/min 離心 10 s，將管壁上的殘余液體甩至管底部，用微量移液器吸干液體，室溫干燥3 min。
f） 使用Pipetty連續(xù)分液模式，加入 11 μL DEPC水，混勻模式，自動(dòng)混勻，以溶解管壁上的 RNA，2 000 r/min 離心5s，置于冰上備用。提取的 RNA 應(yīng)在 2h內(nèi)進(jìn)行 RT-PCR 擴(kuò)增，否則應(yīng)置于-70 ℃冰箱保存。
2、分別使用引物和探針，檢測(cè) PRRSV-1 和 PRRSV-2。實(shí)時(shí) RT-PCR 反應(yīng)體系見(jiàn)表 3。設(shè)置混勻模式，將各種試劑充分混勻，2 000 r/min 離心 2 min。將 15 μL 實(shí)時(shí) RT-PCR 反應(yīng)混合液加入 PCR 反應(yīng)管，然后加入 10 μL樣本 RNA 模板，密封反應(yīng)管，500 r/min 離心30s。將所有檢測(cè)樣本的PCR 管放入熒光 PCR 儀中。每次進(jìn)行實(shí)時(shí) RT-PCR 檢測(cè)均應(yīng)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照及空白對(duì)照。
3、反轉(zhuǎn)錄，42 ℃（AMV）或 50 ℃（M-MLV）30 min；預(yù)變性，92 ℃ 3 min；預(yù)擴(kuò)增，92 ℃ 變性 10 s，45 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 1 min，5 個(gè)循環(huán)；擴(kuò)增，92 ℃變性 10 s，60 ℃ 退火延伸 30 s，40 個(gè)循環(huán)。在擴(kuò)增階段每次循環(huán)的 60 ℃ 退火延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。
四、結(jié)果判定
1、試驗(yàn)成立條件：陽(yáng)性對(duì)照的 Ct 值應(yīng)<28 且出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，陰性對(duì)照應(yīng)無(wú) Ct 值或Ct 值≥40 且無(wú)特異性擴(kuò)增曲線，試驗(yàn)結(jié)果有效，否則，應(yīng)重新進(jìn)行試驗(yàn)。
2、被檢樣本 Ct 值≤30 且出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，判為陽(yáng)性；當(dāng)無(wú) Ct 值或 Ct值≥40，判為陰性；當(dāng)30
方案詳情：
一、實(shí)驗(yàn)原理
實(shí)時(shí)RT-PCR 檢測(cè)豬藍(lán)耳�。≒RRS），核心是針對(duì)豬藍(lán)耳病病毒（PRRSV，RNA 病毒）的實(shí)時(shí) RT-PCR 技術(shù)：先通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄將病毒 RNA 轉(zhuǎn)為可擴(kuò)增的 cDNA，再經(jīng) PCR 循環(huán)（變性、退火、延伸）使病毒靶序列指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)；過(guò)程中利用熒光物質(zhì)（如 TaqMan 探針）實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，熒光信號(hào)隨靶序列增加同步增強(qiáng)；最終以熒光達(dá)閾值的循環(huán)數(shù)（Ct 值）判斷 —Ct 值越小病毒量越高，結(jié)合陰 / 陽(yáng)性對(duì)照，實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒的特異定量檢測(cè)。
二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1、設(shè)配和材料
① Pipetty電動(dòng)移液器MSIC01-03-250、MSIC01-02-1000及配套吸頭；
② 熒光PCR 儀；
③ 高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（4 ℃，離心速度 12 000 r/min 以上）；
④ 混勻器；
⑤ 冰箱（2℃~8 ℃、-20 ℃和-70 ℃）；
2、試劑和材料
① 商品化的 RNA 提取裂解液；
② 三氯甲烷；
③ 異丙醇（-20 ℃預(yù)冷）；
④ DEPC 水；
⑤ 75%乙醇；
⑥ dNTPS（含 dATP、dTTP、dCTP、dGTP，各 10 mmol/L）；
⑦ RT-PCR 反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)：AMV或 M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、Taq酶；
⑧ PRRSV-1 實(shí)時(shí) RT-PCR 引物與探針序列
引物與探針序列根據(jù) GenBank 中歐洲株 ORF6/ORF7 保守區(qū)域序列設(shè)計(jì),引物的序列為：
上游引物 P1：5'-CAGATGCAGAYTGTGTTGCCT-3'；
下游引物 P2：5'-TGGAGDCCTGCAGCACTTTC-3'；
探針序列 P3：5'-(FAM)ATACATTCTGGCCCCTGCCCAYCACGT(TAMRA)-3'；
⑨ PRRSV-2 實(shí)時(shí) RT-PCR 引物與探針序列
引物與探針序列根據(jù) GenBank 內(nèi)美洲株 ORF7/3'UTR 保守區(qū)域序列設(shè)計(jì),引物的序列為：
上游引物 P1：5'-GCACTGATTGACAYTGTGCC-3'；
下游引物 P2：5'-CGCATGGTTCTCGCCAAT-3'；
探針序列 P3：5'-(FAM)AGTCACCTATTCAATTAGGGCGACCG(TAMRA)-3'。
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1、樣本總 RNA 的提取
a） 取滅菌的 1.5 mL離心管，基于樣本數(shù)量進(jìn)行編號(hào)。每管加入 600 μL 細(xì)胞裂解液，使用Pipetty電動(dòng)移液器，設(shè)置連續(xù)分液功能，然后分別加入被檢樣本、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、空白對(duì)照（無(wú)核酸酶水）各 200μL，每加完一個(gè)試劑換用一個(gè)吸頭，再各加入 200 μL 三氯甲烷，在混勻器上振蕩混勻5 s。于4 ℃經(jīng) 12 000 r/min 離心 15 min。
b） 取相同數(shù)量滅菌的 1.5 mL離心管，加入 500μL異丙醇。吸取各管中的上清液（至少 500 μL）轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的管中，并顛倒混勻。
c） 于4 ℃經(jīng) 12 000 r/min 離心 15 min，小心倒去上清液，倒置于吸水紙上吸干液體，然后加入600 μL 75%乙醇進(jìn)行洗滌。
d） 于4 ℃、12 000 r/min 離心 10 min，小心倒去上清液，倒置于吸水紙上吸干液體。
e） 64 000 r/min 離心 10 s，將管壁上的殘余液體甩至管底部，用微量移液器吸干液體，室溫干燥3 min。
f） 使用Pipetty連續(xù)分液模式，加入 11 μL DEPC水，混勻模式，自動(dòng)混勻，以溶解管壁上的 RNA，2 000 r/min 離心5s，置于冰上備用。提取的 RNA 應(yīng)在 2h內(nèi)進(jìn)行 RT-PCR 擴(kuò)增，否則應(yīng)置于-70 ℃冰箱保存。
2、分別使用引物和探針，檢測(cè) PRRSV-1 和 PRRSV-2。實(shí)時(shí) RT-PCR 反應(yīng)體系見(jiàn)表 3。設(shè)置混勻模式，將各種試劑充分混勻，2 000 r/min 離心 2 min。將 15 μL 實(shí)時(shí) RT-PCR 反應(yīng)混合液加入 PCR 反應(yīng)管，然后加入 10 μL樣本 RNA 模板，密封反應(yīng)管，500 r/min 離心30s。將所有檢測(cè)樣本的PCR 管放入熒光 PCR 儀中。每次進(jìn)行實(shí)時(shí) RT-PCR 檢測(cè)均應(yīng)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照及空白對(duì)照。
3、反轉(zhuǎn)錄，42 ℃（AMV）或 50 ℃（M-MLV）30 min；預(yù)變性，92 ℃ 3 min；預(yù)擴(kuò)增，92 ℃ 變性 10 s，45 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 1 min，5 個(gè)循環(huán)；擴(kuò)增，92 ℃變性 10 s，60 ℃ 退火延伸 30 s，40 個(gè)循環(huán)。在擴(kuò)增階段每次循環(huán)的 60 ℃ 退火延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。
四、結(jié)果判定
1、試驗(yàn)成立條件：陽(yáng)性對(duì)照的 Ct 值應(yīng)<28 且出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，陰性對(duì)照應(yīng)無(wú) Ct 值或Ct 值≥40 且無(wú)特異性擴(kuò)增曲線，試驗(yàn)結(jié)果有效，否則，應(yīng)重新進(jìn)行試驗(yàn)。
2、被檢樣本 Ct 值≤30 且出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，判為陽(yáng)性；當(dāng)無(wú) Ct 值或 Ct值≥40，判為陰性；當(dāng)30
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