第二代高通量藥物篩選平臺更容易發(fā)現(xiàn)磷脂酰肌醇信號通路低親合力抑制劑

EJ Dell1, JL Tardieu2, F. Degorce2, Michael Fejtl1

1 BMG LABTECH Inc. NC, USA edward.dell@bmglabtech.com

2 Cisbio Bioassays, 30200 Codolet, France

關(guān)鍵詞：高通量，藥物篩選，HTS，HTRF，Cisbio，BMG Labtech，PHERAstar FS，磷脂酰肌醇信號通路，低親合力，抑制劑，G-蛋白偶聯(lián)受體，GPCRs

摘要:

通過傳統(tǒng)的高通量藥物篩選平臺（HTS）所發(fā)現(xiàn)的可市場化的藥物不僅數(shù)量少，而且市面上大部分的藥物都是小分子量（<500Da）物質(zhì)。這似乎說明，運行于更低體積和更低濃度下的傳統(tǒng)高通量藥物篩選平臺，錯失了發(fā)現(xiàn)更低親合力藥物的機會。

市場的需求催生了下一代高通量藥物篩選平臺——來自德國BMG LABTECH公司的PHERAstar FS，以光電倍增管（PMT）檢測技術(shù)為核心的多功能微孔板檢測儀。與來自另一品牌在行業(yè)中處于領(lǐng)導(dǎo)地位的以CCD相機為技術(shù)核心的微孔板檢測儀進行平行測試。數(shù)據(jù)顯示，PMT微孔板檢測儀（PHERAstar FS）比CCD微孔板檢測儀具有明顯的性能優(yōu)勢：超過2倍的讀數(shù)速度已經(jīng)更加卓越的分析質(zhì)量參數(shù)。更重要的是，PMT微孔板檢測儀（PHERAstar FS）檢測出幾個CCD檢測儀不能發(fā)現(xiàn)的更低親合力的藥物“靶點”。PHERAstar FS，作為新的高通量藥物篩選的黃金標準，將是傳統(tǒng)高通量藥物篩選中用于發(fā)現(xiàn)低親合力復(fù)合物的代表性選擇。

數(shù)據(jù)顯示，PMT微孔板檢測儀與CCD微孔板檢測儀相比：

發(fā)現(xiàn)幾個更低親合力的藥物“hits”（活性化合物）

更好的Z’，分析窗和ΔF%

2倍以上的檢測速度

實例分析:

在這里，我們采用的是Cisbio公司生產(chǎn)的IP-One HTRF®分析——該方案檢測更低應(yīng)答的胞內(nèi)第二信使磷酸肌醇（IP1），磷酸肌醇是三磷酸肌醇（IP3）的下游代謝產(chǎn)物。我們同時對比了兩種不同的高通量篩選微孔板檢測儀（PHERAstar FS和來自另外一個品牌的微孔板檢測儀）對磷脂酰肌醇信號通路低親合力抑制劑的檢測結(jié)果來評估兩種藥物篩選技術(shù)。

背景知識:

G-蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)為跨膜蛋白，是介導(dǎo)細胞外刺激信號的關(guān)鍵角色。GPCRs與胞內(nèi)一系列復(fù)雜的復(fù)合物相互作用調(diào)控非常大量的下游效應(yīng)物質(zhì)。其產(chǎn)物三磷酸肌醇(IP3)是其中一個第二信使，是對Gq-蛋白偶聯(lián)受體被激活的應(yīng)答而產(chǎn)生的。然而，IP3的半衰期非常短，對于藥物篩選而言，是很難對其進行測定的。因此，對由IP3觸發(fā)的鈣釋放的監(jiān)測，作為該信號通路的下游信號被廣泛應(yīng)用。另外一個監(jiān)測IP3的方法是檢測磷酸肌醇（IP1）的累積，磷酸肌醇（IP1）是三磷酸肌醇（IP3）的下游代謝產(chǎn)物。

圖1.IP1的生物合成路徑

利用IP1的穩(wěn)定性和在細胞內(nèi)的可累積性的優(yōu)點，采用IP1單克隆抗體制備優(yōu)化的均相時間分辨熒光 (HTRF®)分析方法。HTRF® IP-One分析方法已經(jīng)與多種現(xiàn)存的方法相比較且得到相似的復(fù)合效能數(shù)據(jù)，且在終點累積的IP1可用于測定緩作用復(fù)合物的作用，這個是鈣流測定沒辦法做到的。HTRF® IP-One分析方法同時可通過定量組成性激活的G蛋白受體來測定反向激動劑，這是測定鈣釋放的方法所不能做到的。最后一點，HTRF® IP-One檢測方法具有比鈣流檢測方法更好的分析穩(wěn)健度和更低的假陽性。IP-One分析方法是Cisbio Bioassays在其專利HTRF®技術(shù)上開發(fā)出來的。 (圖2).

該分析方法采用與IP1特異性結(jié)合的單克隆抗體，其原理是基于胞內(nèi)累積的IP1與其競爭性結(jié)合從而抑制了HTRF®供體和受體之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）。建立一個IP1標準校正曲線可用于計算因復(fù)合物作用而引起的胞內(nèi)累積的IP1的濃度，從而相應(yīng)得到了復(fù)合物的濃度。

圖2: IP-One HTRF 分析原理圖

材料和方法:

黑色1536-孔微孔板，來自于Greiner公司

下一代PMT微孔板檢測儀——PHERAstar FS，來自于德國BMG LABTECH公司

高通量CCD微孔板檢測儀來自于另外生產(chǎn)商

       PHERAstar FS配備高能脈沖氮分子激光，發(fā)射波長為337nm，同時配備了專用的同時雙發(fā)射（SDE）直接光子測定時間分辨熒光模式。當(dāng)激發(fā)鋱(Tb)受體分子時，激光比寬光波段的氙閃燈具有更高的效率。與銪(Eu)相比，激光的高能量使得激發(fā)峰在337nm左右的鋱穴合物有更高的分子激發(fā)效率。Greiner的1536-孔微孔板用于5μL體系的分析。如圖3所示，1408個不同的復(fù)合物移液到微孔板的前44列中，陽性對照(POS,n=64)和陰性對照(NEG, n=64)移液到最后4列中。

圖3: BMG LABTECH多功能酶標儀PHERAstar FS

圖4: 1536-孔微孔板布局

結(jié)果與討論:

通過計算兩個發(fā)射波長(Em 665 nm / Em 620 nm) 下的HTRF®比率來評估分析結(jié)果， 1536微孔板的3維表面圖的尖峰表示得到的hits（活性化合物）。

圖5: 用PHERAstar FS測得的IP-One HTRF® 比率

圖6: 用CCD微孔板檢測儀測得的IP-One HTRF® 比率

當(dāng)對比同一塊微孔板在兩個儀器上讀數(shù)結(jié)果時，很明顯只有PHERAstar FS給出了陽性結(jié)果，而CCD微孔板檢測儀并沒有給出明顯的尖峰。

結(jié)論:

用現(xiàn)有的處于領(lǐng)導(dǎo)地位的CCD微孔板檢測儀不能發(fā)現(xiàn)的低親合力復(fù)合物用PMT微孔板檢測儀PHERAstar FS可以很容易的檢測出來。

相關(guān)介紹:

HTRF: HTRF^® 是均相時間分辨熒光技術(shù)的簡稱，HTRF^® 技術(shù)是對TR-FRET技術(shù)的進一步改良，提供了更高的靈敏度和穩(wěn)定性，為法國Cisbio公司的專利技術(shù)。Cisbio Bioassays是一家超過50年歷史的生命科學(xué)、醫(yī)療診斷和藥物研發(fā)公司。Cisbio Bioassays公司所銷售的基于HTRF技術(shù)的產(chǎn)品包括：IP1, cAMP, Cellul’erk以及Tag-lite™細胞表面受體平臺。在眾多HTRF®的檢測儀器中，BMG LABTECH的PHERAstar FS為Cisbio公司的推薦儀器。

BMG LABTECH：BMG LABTECH是一家超過20年歷史的德國公司，多功能酶標儀是其唯一專注的產(chǎn)品，其多功能酶標儀以專業(yè)、高端而著稱于市場，是科研和藥物篩選的最佳選擇。特別是FLUOstar Omega（榮獲“2010年科學(xué)家的選擇之最佳藥物篩選產(chǎn)品”）以及PHERAstar FS（Cisbio公司推薦HTRF®檢測儀器）更是多功能酶標儀領(lǐng)域的驕子。香港伯齊科技有限公司為BMG LABTECH在中國大陸和香港、澳門的唯一授權(quán)代理商。

采用Cisbio IP-One和PHERAstar FS相結(jié)合所發(fā)表的文章：

1. Monitoring Gq-coupled receptor response through inositol phosphate quantification with the IP-One assay

2. Implementation of Cisbio’s HTRF® M1 muscarinic receptor related assays on CyBio liquid handling solutions for small and high throughput

3. Quantifying Ligand Bias at Seven-Transmembrane Receptors

4. A High-Throughput Small-Molecule Ligand Screen Targeted to Agonists and Antagonists of the G-Protein-Coupled Receptor GPR54

5. Illuminating the activation mechanisms and allosteric properties of metabotropic glutamate receptors

6. Facilitatory Interplay in α1a and β2 Adrenoceptor Function Reveals a Non-Gq Signaling Mode: Implications for Diversification of Intracellular Signal Transduction

7. High-Throughput Identification and Characterization of Novel, Species-selective GPR35 Agonists

9. Selective Orthosteric Free Fatty Acid Receptor 2 (FFA2) Agonists

IDENTIFICATION OF THE STRUCTURAL AND CHEMICAL REQUIREMENTS FOR SELECTIVE ACTIVATION OF FFA2 VERSUS FFA3

10.Slow Receptor Dissociation Kinetics Differentiate Macitentan from Other Endothelin Receptor Antagonists in Pulmonary Arterial Smooth Muscle Cells

11. Homogeneous time-resolved fluorescence-based assay to screen for ligands targeting the growth hormone secretagogue receptor type 1a

12. Antagonists of GPR35 display high species ortholog selectivity and varying modes of action

13. Human cytomegalovirus-encoded UL33 and UL78 heteromerize with host CCR5 and CXCR4 impairing their HIV coreceptor activity

14: Selectively Engaging β-Arrestins at the Angiotensin II Type 1 Receptor Reduces Blood Pressure and Increases Cardiac Performance

15.Inactivation of the Constitutively Active Ghrelin Receptor Attenuates Limbic Seizure Activity in Rodents

16. Identification and Profiling of Novel α1A-Adrenoceptor-CXC Chemokine Receptor 2 Heteromer*

17. A Selective Luminescent Probe for the Direct Time-Gated Detection of Adenosine Triphosphate

18. Etablierung von Frozen Instant Assays mit kryokonservierten Zellen in 384-Well-Platten für Hochdurchsatzscreenings