細(xì)胞轉(zhuǎn)染助力解析免疫信號(hào)通路和細(xì)胞功能機(jī)制
免疫細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)的核心成員，包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等。它們在識(shí)別病原體、清除腫瘤細(xì)胞、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。近年來，隨著細(xì)胞治療和基因編輯技術(shù)的發(fā)展，對(duì)免疫細(xì)胞進(jìn)行定向改造已成為基礎(chǔ)研究與臨床轉(zhuǎn)化的重要方向。
為了實(shí)現(xiàn)對(duì)免疫細(xì)胞功能的精準(zhǔn)調(diào)控，研究人員常需將外源物質(zhì)（如DNA、mRNA、siRNA或CRISPR-Cas9等）導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，這一過程稱為轉(zhuǎn)染。通過轉(zhuǎn)染，可以過表達(dá)目標(biāo)蛋白（如嵌合抗原受體CAR）、敲低或敲除特定基因、引入報(bào)告系統(tǒng)，或遞送抗原編碼序列以激活免疫應(yīng)答。這些操作不僅有助于解析免疫信號(hào)通路和細(xì)胞功能機(jī)制，更是CAR-T療法、mRNA疫苗、基因編輯免疫細(xì)胞等前沿技術(shù)得以實(shí)現(xiàn)的前提。
免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的部分應(yīng)用場景
A. 免疫治療 B. 免疫調(diào)控
實(shí)現(xiàn)細(xì)胞轉(zhuǎn)染方式繁多，依據(jù)原理可大致分為化學(xué)法、物理法及生物法�；瘜W(xué)法以脂質(zhì)體法為代表，通過利用人工合成的陽離子脂質(zhì)體與帶負(fù)電荷的核酸自組裝形成復(fù)合物，通過細(xì)胞內(nèi)吞作用將外源核酸遞送入細(xì)胞。物理法以電穿孔法和顯微注射法為代表，通過電脈沖或壓力使細(xì)胞膜穿孔，從而將外源核酸或蛋白質(zhì)遞送入細(xì)胞。生物法則以病毒介導(dǎo)法為主，通過利用改造后的病毒（如慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒）為載體，將外源基因?qū)爰?xì)胞。
細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方式
然而，免疫細(xì)胞，因其細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)致密、分裂緩慢且對(duì)外界刺激敏感，往往對(duì)化學(xué)法轉(zhuǎn)染響應(yīng)極差。常用的化學(xué)轉(zhuǎn)染試劑（如脂質(zhì)體）在這些細(xì)胞中效率低下，且易引發(fā)細(xì)胞毒性或非特異性活化，嚴(yán)重影響后續(xù)功能評(píng)估。病毒載體雖能實(shí)現(xiàn)較高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，但存在構(gòu)建復(fù)雜、周期長、成本高及潛在生物安全風(fēng)險(xiǎn)等問題。而顯微注射法主要用于大尺度細(xì)胞（如胚胎）。電穿孔則利用短暫高壓電脈沖在細(xì)胞膜上形成可逆微孔以促進(jìn)核酸進(jìn)入，因其高效、快速、無需病毒載體且適用于多種核酸，逐漸成為免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)染的首選策略。
免疫細(xì)胞電轉(zhuǎn)染案例
①利用PB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)構(gòu)建GPC3CAR重組質(zhì)粒，隨后利用電穿孔方式將質(zhì)粒遞送入T細(xì)胞，從而成功構(gòu)建特異性CAR-T細(xì)胞（GPC3CAR-T），并在體外和體內(nèi)驗(yàn)證其抗腫瘤活性，為肝細(xì)胞癌的臨床治療提供新策略[1]。
GPC3CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤活性
②利用電穿孔將NKG7-mRNA轉(zhuǎn)染T細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)會(huì)提升非響應(yīng)者分離的人類T細(xì)胞的腫瘤-細(xì)胞殺傷能力，并增強(qiáng)其體外抗PD-1或抗PD-L1治療的反應(yīng)。該療法還在體內(nèi)提升了小鼠腫瘤抗原特異性CD8 T細(xì)胞的抗腫瘤活性。研究證明轉(zhuǎn)錄因子ETS1在調(diào)控NKG7表達(dá)中起到了作用。研究確認(rèn)NKG7是CD8 T細(xì)胞細(xì)胞毒性功能的必要組成部分，并確立了NKG7作為增強(qiáng)癌癥免疫治療的T細(xì)胞內(nèi)在治療靶點(diǎn)[2]。
NKG7表達(dá)減少會(huì)導(dǎo)致CD8 T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷減少
Extransfection™細(xì)胞電轉(zhuǎn)染系統(tǒng)及轉(zhuǎn)染案例
ExTransfection第三代毛細(xì)管型電轉(zhuǎn)儀區(qū)別于傳統(tǒng)的電轉(zhuǎn)設(shè)備的電擊杯耗材，以獨(dú)特的毛細(xì)管型電擊槍頭設(shè)計(jì)，確保毛細(xì)管的絕緣，并減少電極表面積，同時(shí)增大電極間距大，從而形成穩(wěn)定電場。該設(shè)計(jì)可以最大限度地減少氣泡的形成和電解。因此，在高度敏感型的免疫細(xì)胞電轉(zhuǎn)中，能顯著提高效率且降低細(xì)胞損傷。
ExTransfection的Gold-Tip設(shè)計(jì)及與傳統(tǒng)電擊杯的區(qū)別
ExTransfection除高效高活率特點(diǎn)外，還兼具適用性廣、安全風(fēng)險(xiǎn)低、可優(yōu)化度高、可重復(fù)性強(qiáng)等優(yōu)勢特點(diǎn)。例如，廣泛適用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞類型，可遞送DNA、RNA及RNP復(fù)合物；非病毒轉(zhuǎn)染可降低免疫原性及插入突變風(fēng)險(xiǎn)；無縫兼容10μL及100μL兩種體系；內(nèi)置300+細(xì)胞轉(zhuǎn)染參數(shù)及24孔板優(yōu)化方案等等。
轉(zhuǎn)染免疫相關(guān)細(xì)胞案例，均以0.5μg EGFP-plasmid轉(zhuǎn)染細(xì)胞，24h后檢測熒光表達(dá)情況，結(jié)果顯示ExTransfection轉(zhuǎn)染免疫細(xì)胞能兼具轉(zhuǎn)染效率與細(xì)胞活率。
此外，奎克泰生物推出免疫細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的綜合解決方案，以細(xì)胞復(fù)蘇儀、自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀、電轉(zhuǎn)儀以及活細(xì)胞成像儀產(chǎn)品為依托，從免疫細(xì)胞復(fù)蘇到動(dòng)態(tài)變化監(jiān)測每一步實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)記錄和量化分析。
Reference
[1] Wang P, Qin W, Liu T, Jiang D, Cui L, Liu X, Fang Y, Tang X, Jin H, Qian Q. PiggyBac-engineered T cells expressing a glypican-3-specific chimeric antigen receptor show potent activities against hepatocellular carcinoma. Immunobiology. 2020 Jan;225(1):151850. doi: 10.1016/j.imbio.2019.09.009.
[2] Wen T, Barham W, Li Y, Zhang H, Gicobi JK, Hirdler JB, Liu X, Ham H, Peterson Martinez KE, Lucien F, Lavoie RR, Li H, Correia C, Monie DD, An Z, Harrington SM, Wu X, Guo R, Dronca RS, Mansfield AS, Yan Y, Markovic SN, Park SS, Sun J, Qin H, Liu MC, Vasmatzis G, Billadeau DD, Dong H. NKG7 Is a T-cell-Intrinsic Therapeutic Target for Improving Antitumor Cytotoxicity and Cancer Immunotherapy. Cancer Immunol Res. 2022 Feb;10(2):162-181. doi: 10.1158/2326-6066.CIR-21-0539.
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