作者 | 徐六康

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摘要

本文介紹了如何將 LI-7825 CO₂ 同位素氣體分析儀與智能測量室（Smart Chamber，8200-01） 結(jié)合使用，用于測定土壤呼吸 CO₂ 的碳同位素組成（δ¹³C）。

LI-7825便攜式土壤碳源δ¹³C及CO₂通量自動測量系統(tǒng)

為提升測量精度，LI-COR 近期在智能測量室中新增了水汽瞬態(tài)緩沖器（適用于序列號 82S-2088 及以上的設(shè)備）。在氣室關(guān)閉并采樣的過程中，該緩沖器能夠有效穩(wěn)定輸送至 LI-7825 的水汽濃度，從而顯著減小水汽波動對 δ¹³C 測定結(jié)果的影響。測量時，空氣從氣室流出，經(jīng)過水汽緩沖器進入 LI-7825 分析，隨后再返回氣室，形成一個穩(wěn)定的閉合循環(huán)系統(tǒng)。

本文首先介紹 Keeling Plot 分析方法，以及 LI-COR 開發(fā)的一種基于 ¹³CO₂ 與 ¹²CO₂ 線性變化斜率的土壤呼吸 δ¹³C 反演新方法。隨后，詳細說明 LI-7825 與智能測量室之間的時間同步與數(shù)據(jù)合并流程，最后講解如何使用 SoilFluxPro™ 軟件 對數(shù)據(jù)進行分析與處理。

1｜Keeling Plot方法

Keeling Plot 方法已被廣泛用于解析生態(tài)系統(tǒng)呼吸（Pataki et al., 2003）、土壤呼吸（Flanagan et al., 1999）以及其他 CO₂ 來源的穩(wěn)定碳同位素組成（δ¹³C）。在采用封閉氣室法（Closed-chamber Method）測量土壤 CO₂ 通量時，可以利用 Keeling Plot 方法反演由土壤呼吸產(chǎn)生的 CO₂ 的 δ¹³C 特征值（Flanagan et al., 1999）。

該方法的基本思想是：將氣室內(nèi)空氣的 δ¹³C 與其對應(yīng)的 CO₂ 濃度倒數(shù)（1/[CO₂]）進行線性回歸分析。在理想混合條件下，回歸直線在縱軸上的截距可視為呼吸源 CO₂ 的碳同位素比值，即土壤呼吸 CO₂ 的 δ¹³C 表征值（Pataki et al., 2003）。

圖1A 給出了一個 Keeling Plot 分析示例。該實驗基于封閉系統(tǒng)測量，使用的儀器包括智能測量室和 LI-7825 CO₂ 同位素氣體分析儀。實驗中，智能測量室放置在帶密封底座的環(huán)座上，底座內(nèi)部填充潮濕的大豆生物材料。在2分鐘的測量周期內(nèi)，通過 Keeling Plot 回歸分析得到的截距為 −29.10‰，該值代表該 CO₂ 來源（大豆生物材料）的碳同位素組成。該結(jié)果與典型 C₃ 植物的 δ¹³C 范圍高度一致。

圖1B 顯示了測量過程中氣室內(nèi) CO₂ 濃度隨時間變化的時間序列。在構(gòu)建 Keeling Plot 并進行線性回歸時，為避免氣室關(guān)閉初期因氣體混合不充分對結(jié)果造成影響，分析中剔除了前 20s 的數(shù)據(jù)點。

2｜利用斜率法確定土壤呼吸的 δ¹³C

樣品材料的碳同位素比值（δ¹³C）定義如下（Farquhar et al., 1989）：

（公式1）

其中，(C13/C12)_sample  表示樣品中 ¹³CO₂ 與 ¹²CO₂ 的摩爾比；(C13/C12)_std 表示標準物質(zhì)——維也納皮迪箭石（Vienna Pee Dee Belemnite，VPDB）的摩爾比，其標準值為 0.0112372。

圖 1 采用封閉氣室法并通過 Keeling Plot 分析確定 CO₂ 來源碳同位素比值的示例。該數(shù)據(jù)集由 LI-7825 碳同位素氣體分析儀與智能測量室獲取。實驗中，智能測量室放置在帶密封底座的環(huán)座上，底座內(nèi)填充有潮濕的大豆生物材料，實驗地點位于 LI-COR 園區(qū)溫室。氣室關(guān)閉時間為 120s。其中，面板 A 為 Keeling Plot 分析結(jié)果，面板 B 為氣室內(nèi) CO₂ 濃度隨時間變化的時間序列。

由于 LI-7825 可分別測量 ¹²CO₂ 和 ¹³CO₂，因此可以直接利用封閉氣室測量數(shù)據(jù)，計算 ¹³C 相對于 ¹²C 的線性變化斜率。在假設(shè)土壤有機質(zhì)（SOM）分解過程中不存在同位素分餾的前提下，該斜率可視為 SOM 中 ¹³C 與 ¹²C 的摩爾比。在此基礎(chǔ)上，公式（1）可改寫為：

（公式2）

其中，(C13/C12)_slope  表示在氣室測量過程中，將 ¹³CO₂ 濃度對 ¹²CO₂ 濃度作圖所得到的線性斜率。圖 2 給出了利用該斜率法確定大豆生物材料 δ¹³C 的示例。

圖 2 通過 ¹³C 與 ¹²C 線性斜率計算 CO₂ 來源 δ¹³C 的過程。當線性斜率為 0.0109088，且標準物質(zhì) (C13/C12)_std 為 0.0112372 時，計算得到的 δ¹³C 值為 −29.22‰。該數(shù)據(jù)集與圖 1A 中用于 Keeling Plot 分析的數(shù)據(jù)幾乎完全相同。

在本次測試中，將潮濕的大豆生物材料放置于智能測量室內(nèi)部后關(guān)閉氣室，LI-7825 連續(xù) 2 分鐘測量¹³CO₂ 和¹²CO₂。結(jié)果顯示，¹³C 對¹²C 作圖的線性斜率為0.0109088，決定系數(shù) R² = 1.0（見圖2）。結(jié)合 (C13/C12)_std =0.0112372，計算得到大豆生物材料的 δ¹³C 為 −29.22‰。該結(jié)果與圖 1A 中通過 Keeling Plot 方法得到的 δ¹³C 值幾乎完全一致，表明兩種方法在本次測量中具有良好的一致性。

3｜智能測量室（Smart Chamber）與 LI-7825 的時間同步

有關(guān)智能測量室與 LI-7825 之間線纜及氣路組件的安裝方法，請參閱“初始設(shè)置（Initial Setup）”章節(jié)。

由于 LI-7825 測得的氣體濃度數(shù)據(jù)不會寫入智能測量室生成的數(shù)據(jù)文件（*.json），因此在后期數(shù)據(jù)處理中，需要借助 SoilFluxPro™ 軟件，按照時間戳將兩臺儀器采集的數(shù)據(jù)進行合并。在這一過程中，確保智能測量室與 LI-7825 的系統(tǒng)時鐘嚴格同步是實現(xiàn)數(shù)據(jù)準確匹配的關(guān)鍵。

在開始測量前，請使用隨附的以太網(wǎng)電纜和氣路組件將 LI-7825 與智能測量室正確連接，并確認兩臺儀器的時區(qū)設(shè)置一致。隨后，在 LI-7825 的時間設(shè)置界面中啟用 Auto Sync（自動同步） 功能，選擇 NTP 作為同步方式，并將智能測量室的主機名（例如 82s-2044.local）填寫為時間服務(wù)器（見圖3）。完成設(shè)置后，LI-7825 通�？稍� 2–3 分鐘內(nèi)與智能測量室完成時鐘同步。

圖 3 在 LI-7825 的 Settings 頁面中啟用 Auto Sync 和 NTP 選項，并在 NTP 輸入框中填寫智能測量室主機名。

需要注意的是，智能測量室的系統(tǒng)時間會自動與 GPS 時間同步。因此，在正式開始測量前，應(yīng)確保氣室已成功獲得 GPS 鎖定，否則可能導(dǎo)致數(shù)據(jù)時間戳出現(xiàn)跳變。用戶可在智能測量室界面的 Settings > Diagnostics 頁面中查看并確認 GPS 鎖定狀態(tài)。

完成時間同步后，即可在智能測量室界面中配置測量方案。目前，智能測量室的軟件界面尚不支持將 LI-7825 直接添加為外部分析儀，但這一限制并不會影響實際測量流程。由于氣體濃度數(shù)據(jù)不會寫入智能測量室的數(shù)據(jù)文件（*.json），在未連接 LI-870 等輔助氣體分析儀的情況下，野外測量時將無法實時查看 CO₂ 通量結(jié)果。

在高濕環(huán)境下進行現(xiàn)場測量時，建議適當延長 Post Purge（后吹掃）時間（例如設(shè)置為 7 分鐘或更長），以幫助氣室內(nèi)的水汽瞬態(tài)緩沖器充分恢復(fù)其緩沖能力。在后吹掃階段將氣室抬起，也有助于加快氣室內(nèi)部水汽濃度的恢復(fù)。

有關(guān)從智能測量室和 LI-7825 下載數(shù)據(jù)的具體操作步驟，請參閱各自對應(yīng)的用戶手冊。

4｜使用 SoilFluxPro 軟件合并數(shù)據(jù)

使用 SoilFluxPro™（SFP） 軟件打開智能測量室生成的數(shù)據(jù)文件（*.json），隨后按照以下步驟，將 LI-7825 采集的碳同位素氣體濃度數(shù)據(jù)導(dǎo)入 SFP（見圖 4）。

圖 4 將 LI-7825 數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入 SoilFluxPro 的操作流程。

• 在菜單欄中點擊 Import，打開數(shù)據(jù)導(dǎo)入界面。

• 點擊 + ADD FILES，選擇需要導(dǎo)入的 LI-7825 數(shù)據(jù)文件。

• 勾選需要導(dǎo)入的變量，并為每個變量指定對應(yīng)的單位。

  如果希望 SFP 自動計算氣體通量，請勾選單位欄右側(cè)的復(fù)選框，并設(shè)置通量計算所需的 Deadband 和 Stop time 參數(shù)。

  如果分析重點僅為碳同位素組成，則只需導(dǎo)入 CO₂（總 CO₂ 濃度）、  C12（¹²CO₂）、C13（¹³CO₂） 以及 C13_DELTA（δ¹³C） 這幾個變量。

  對于不需要的變量，可取消勾選，使其不被導(dǎo)入 SFP。

  同時建議導(dǎo)入 LI-7825 的診斷代碼（Diagnostic Codes），以便在后續(xù)結(jié)果的質(zhì)量控制（QA/QC）過程中參考儀器運行狀態(tài)。

• 點擊 Import 按鈕，完成數(shù)據(jù)導(dǎo)入。

5｜基于 Keeling Plot與斜率法反演土壤呼吸的 δ¹³C

將 LI-7825 生成的數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入 SoilFluxPro™（SFP） 軟件后，可按照以下步驟，分別采用 Keeling Plot 回歸法 和 斜率回歸法（Slope Regression） 計算土壤呼吸 CO₂ 的碳同位素比值（δ¹³C）（見圖 5）。

圖 5 在 SFP 中配置 Keeling Plot 法和斜率法所需變量的操作流程。

• 在 SFP 軟件中，點擊Isotope，并在界面右上角選擇Add New Regression，隨后按以下方式進行設(shè)置：

• Keeling Plot 回歸（Keeling Regression）

  將 LI-7825-C13_DELTA（δ¹³C） 設(shè)為 Minor gas source；

  將 LI-7825-CO₂ 設(shè)為 Major gas source。

• 斜率回歸（Slope Regression）

  將 LI-7825-C13（¹³CO₂） 設(shè)為 Minor gas source；

  將 LI-7825-C12（¹²CO₂） 設(shè)為 Major gas source。

• 完成變量設(shè)置后，點擊 Create 按鈕，執(zhí)行回歸計算。

計算完成后，軟件界面將顯示每次觀測對應(yīng)的 Keeling Plot 法 和 斜率法 的分析結(jié)果（見圖 6）。

圖 6 單次觀測對應(yīng)的 Keeling Plot 與斜率法計算結(jié)果。

點擊 (KEELING)，可查看所選觀測的 Keeling Plot 分析詳情（見圖 7）。

圖 7 單次觀測的 Keeling Plot 分析結(jié)果。在本示例中，Keeling Plot 回歸得到的土壤呼吸 δ¹³C 為 −30.53824‰。

點擊 (SLOPE)，可查看同一觀測對應(yīng)的斜率法分析結(jié)果（見圖 8）。

該方法計算得到的土壤呼吸 δ¹³C 為 −30.45391‰。

圖 8 與圖7相同觀測對應(yīng)的斜率法分析結(jié)果。

如需采用不同的標準同位素比值 (C13/C12)_std ，可直接在軟件中（Isotopic Standard）輸入新的數(shù)值，并點擊 Apply 進行更新。

完成分析后，可將項目保存為 .82z 文件格式，以完整保留同位素分析參數(shù)、回歸結(jié)果及所有計算設(shè)置。有關(guān)結(jié)果導(dǎo)出及進一步數(shù)據(jù)分析的方法，請參閱 “從儀器下載數(shù)據(jù)（Downloading data from the instrument）” 章節(jié)。

6｜注意事項

在野外條件下，將智能測量室（Smart Chamber）與 LI-7825 聯(lián)合用于土壤呼吸 δ¹³C 測量時，建議重點關(guān)注以下事項，以降低測量不確定性并提高結(jié)果可靠性。

零點與量程校準

在開展野外測量前，應(yīng)對 LI-7825 進行零點校準。為獲得最佳測量性能，建議每天外出測量前執(zhí)行一次零點校準。量程校準通常建議每月進行一次。有關(guān)具體校準步驟及推薦使用的標準氣體，請參閱 LI-7825 使用說明書中的 Maintenance 章節(jié)。

觀測時長設(shè)置

LI-7825 的數(shù)據(jù)輸出頻率為 1 Hz。在大多數(shù)情況下，約2分鐘的封閉氣室觀測即可產(chǎn)生足夠的 CO₂ 濃度變化，用于穩(wěn)定同位素分析。對于 CO₂ 通量較低的樣點，應(yīng)適當延長觀測時間，以確保 CO₂ 濃度增量約 50 ppm（參見 Pataki et al., 2003）。根據(jù)經(jīng)驗，約 50 ppm 的 CO₂ 增量即可滿足 Keeling Plot 法和斜率法反演土壤呼吸 δ¹³C 的基本要求。

儀器運行狀態(tài)

為保證同位素分析儀的穩(wěn)定運行并減少預(yù)熱帶來的影響，建議在整個野外測量期間保持 LI-7825 處于開啟狀態(tài)。在不進行測量時，可將儀器連接至交流電源，以維持電池電量。

NH₃ 測量說明

LI-7825 可測量 CO₂、δ¹³C、δ¹⁷O、δ¹⁸O 以及 NH₃。盡管 NH₃ 濃度測量本身是準確的，但由于樣品在進入分析儀前，部分 NH₃ 會吸附在管路及其他表面，進入分析儀的 NH₃ 濃度可能無法真實反映原始樣品水平。因此，不建議使用該系統(tǒng)進行 NH₃ 通量測量。

水汽瞬態(tài)緩沖器

序列號為 82S-2088 及以上的智能測量室已內(nèi)置水汽瞬態(tài)緩沖器。對于較早型號的智能測量室，可在氣室 Air Outlet 接口處加裝外置水汽瞬態(tài)緩沖組件（部件號：9982-112），以減小水汽變化對同位素測量的影響。

如需進一步技術(shù)支持，請聯(lián)系 北京萊闊生物科技有限公司（LI-COR 中國），電話 400-1131-511。

7 | 參考文獻

• Farquhar, G.D., Ehleringer, J.R. and Hubick, K.T. (1989). Carbon Isotope Discrimination and Photosynthesis. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, 40(1), pp.503–537. doi:https://doi.org/10.1146/annurev.pp.40.060189.002443.

• Flanagan, L.B., Kubien, D.S. and Ehleringer, J.R. (1999). Spatial and temporal variation in the carbon and oxygen stable isotope ratio of respired CO2 in a boreal forest ecosystem. Tellus B: Chemical and Physical Meteorology, 51(2), pp.367–384. doi:https://doi.org/10.3402/tellusb.v51i2.16306.

• Pataki, D.E., Ehleringer, J.R., Flanagan, L.B., Yakir, D., Bowling, D.R., Still, C.J., Buchmann, N., Kaplan, J.O. and Berry, J.A. (2003). The application and interpretation of Keeling plots in terrestrial carbon cycle research. Global Biogeochemical Cycles, 17(1). doi:https://doi.org/10.1029/2001gb001850.

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