Covaris超聲片段化技術(shù)的常見(jiàn)問(wèn)題與解答
超聲打斷是最常見(jiàn)的DNA片段化方式，超聲波產(chǎn)生的剪切力能夠?qū)⑷芤褐械腄NA片段進(jìn)行剪切。
常用的超聲波打斷儀分為接觸式和非接觸式，其中接觸式打斷儀價(jià)格較低，但是需要將超聲波探頭插入到樣本中進(jìn)行打斷，容易造成打斷不均勻，樣本損失以及交叉污染等問(wèn)題。非接觸式打斷儀不需要將探頭插入到樣品中，因此可以有效的避免上述問(wèn)題。
非接觸式的打斷儀以Covaris超聲波破碎系統(tǒng)最為常用，配合專門(mén)的Covaris打斷管，可以將DNA精確打斷成目標(biāo)大小。超聲打斷會(huì)使得DNA的末端產(chǎn)生寡核苷酸突出，這些末端突出需要通過(guò)末端修復(fù)過(guò)程將其補(bǔ)平，之后才能進(jìn)行加A和加接頭等后續(xù)步驟。
在使用該系統(tǒng)打斷之前，總會(huì)遇到各種層出不窮的問(wèn)題，今天我們列舉最常見(jiàn)的5個(gè)問(wèn)題進(jìn)行解答。
1 使用Covaris 超聲打斷儀能獲得哪些范圍內(nèi)的DNA片段？
Covaris儀器能夠提供可調(diào)節(jié)的DNA片段大小，范圍從150bp至5000bp。采用AFA能量進(jìn)行隨機(jī)剪切，可生成呈對(duì)數(shù)正態(tài)分布的DNA片段圖譜。可根據(jù)儀器型號(hào)以及打斷管規(guī)格選擇程序。
2 除了磷酸二酯鍵外，使用Covaris儀對(duì)樣本進(jìn)行處理的過(guò)程中，是否有其他鍵被斷裂？
迄今為止，尚未有研究能夠證明超聲會(huì)對(duì)DNA分子內(nèi)部化學(xué)鍵的影響。從數(shù)以億計(jì)的堿基序列中獲得的間接證據(jù)在很大程度上表明，僅會(huì)斷裂磷酸二酯鍵。
3 在進(jìn)行DNA超聲打斷時(shí)，建議使用哪種緩沖液？
推薦使用 Tris-EDTA pH 8.0 緩沖液（TE），它能確保在處理不同大小的DNA片段時(shí)都能獲得一致的結(jié)果。
4 打斷管內(nèi)部有一根纖維，這根纖維有什么用途？處理過(guò)程中這根纖維會(huì)污染樣本？
管內(nèi)的纖維具備雙重功能。首先，它為慣性空化提供成核位點(diǎn)。空化是指液體中氣泡急劇坍縮，產(chǎn)生微射流從而裂解DNA的過(guò)程。其次，它能在處理過(guò)程中實(shí)現(xiàn)樣品的高效混合。這種聲學(xué)纖維在裝入試管前已通過(guò)制造工藝徹底清潔，確保無(wú)任何有機(jī)污染物殘留。
5 為什么在進(jìn)行DNA打斷時(shí)總是結(jié)果不一致不穩(wěn)定？
結(jié)果不一致可能由多種因素引起，但以下幾點(diǎn)是首先需要檢查的重要事項(xiàng)：
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樣品體積： 每種耗材均針對(duì)特定樣品體積進(jìn)行了優(yōu)化，以確保最佳性能。例如，過(guò)大的頂空可能導(dǎo)致試管內(nèi)偶爾形成氣隙，從而破壞DNA持續(xù)穩(wěn)定地片段化至目標(biāo)尺寸范圍。
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水位： 水位對(duì)于DNA片段化至關(guān)重要。水不僅能使聲能從換能器耦合至試管中，還在處理過(guò)程中保持樣品處于適宜溫度、以及最小化可能導(dǎo)致玻璃試管破裂的振動(dòng)方面起著重要作用。每臺(tái)儀器和耗材都有具體的應(yīng)遵循水位要求。
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水浴溫度： 水溫應(yīng)嚴(yán)格控制并與應(yīng)用相匹配。較高的溫度會(huì)減弱樣品流體中聲學(xué)空穴坍塌的力度，導(dǎo)致平均片段大小向更大尺寸偏移，因此DNA片段化過(guò)程中的水浴溫度應(yīng)嚴(yán)格控制。
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水的脫氣水平： 對(duì)于S、E和LE系列儀器，水浴中脫氣不足可能導(dǎo)致聲學(xué)耦合效率降低，從而改變平均片段大小。系統(tǒng)脫氣泵應(yīng)在進(jìn)行AFA處理前和處理過(guò)程中提前運(yùn)行。在處理開(kāi)始前，水浴應(yīng)至少脫氣30分鐘至1小時(shí)，直至能夠在SonoLab軟件中無(wú)錯(cuò)誤地勾選"degas"指示器。
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水純度： 藻類及顆粒物等雜質(zhì)可能會(huì)散射高頻聚焦聲束，導(dǎo)致平均片段大小向更大尺寸偏移。水浴用水應(yīng)為純凈蒸餾水或去離子水，每日更換或使用Covaris水循環(huán)處理系統(tǒng)進(jìn)行清潔。
麥伯超聲打斷管
麥伯50μl超聲打斷管/ 130μL超聲打斷管，是Covaris系列超聲波剪切儀適配樣品管。利用聲波自動(dòng)聚焦AFA技術(shù)，機(jī)械剪切DNA/RNA，所得片段DNA無(wú)熱損傷無(wú)偏好，片段化范圍150bp-1.5kb，具有高度的可重復(fù)性，適用于測(cè)序建庫(kù)等核酸片段化過(guò)程。
即將上線更多規(guī)格超聲打斷管(8聯(lián)管/96孔板)，敬請(qǐng)期待!
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