神經(jīng)管缺陷（NTDs）是一種復(fù)雜的多基因疾病，也是影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的最常見(jiàn)且嚴(yán)重的先天性畸形。研究已發(fā)現(xiàn)PCSK9可作為胎兒早期產(chǎn)前診斷NTD的分子標(biāo)志物，但其導(dǎo)致在神經(jīng)管發(fā)生的具體機(jī)制中仍不清楚。2025年8月，來(lái)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院的袁正偉研究團(tuán)隊(duì)在期刊Advanced Science（IF: 14.1）上發(fā)表了一篇題為“PCSK9 Loss-of-Function Disrupts Cellular Microfilament Network via LIN28A/HES5/JMY Axis in Neural Tube Defects”的研究文章。本研究通過(guò)將PCSK9敲除胚胎干細(xì)胞（ESC）和PCSK9 R46L點(diǎn)突變的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）分別引入神經(jīng)類(lèi)器官（NOs）和神經(jīng)祖細(xì)胞（NPCs）模型，發(fā)現(xiàn)PCSK9缺失通過(guò)LIN28A/HES5/JMY軸破壞細(xì)胞微絲網(wǎng)絡(luò)，最終導(dǎo)致NTDs的發(fā)生。這些發(fā)現(xiàn)為NTD的發(fā)病機(jī)制研究和治療策略提供了重要見(jiàn)解。

圖片來(lái)源：《Advanced Science》
（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40788992/）

研究材料與方法
本研究前期從臨床檢測(cè)數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)PCSK9缺失與神經(jīng)管畸形的發(fā)生密切相關(guān)，所以通過(guò)構(gòu)建PCSK9敲除ESC和PCSK9 R46L點(diǎn)突變的iPSC（由賽業(yè)生物提供），分別結(jié)合三維神經(jīng)類(lèi)器官和二維神經(jīng)祖細(xì)胞分化體系上，利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選出關(guān)鍵分子JMY，并通過(guò)染色質(zhì)免疫沉淀、熒光素酶報(bào)告基因等技術(shù)證實(shí)HES5轉(zhuǎn)錄激活JMY的表達(dá)機(jī)制。進(jìn)一步通過(guò)免疫共沉淀和溶酶體抑制實(shí)驗(yàn)，揭示PCSK9作為分子伴侶介導(dǎo)LIN28A的溶酶體降解途徑。并分別在細(xì)胞，類(lèi)器官和斑馬魚(yú)模型中，通過(guò)基因敲降和過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了LIN28A/HES5/JMY軸在神經(jīng)管發(fā)育中的關(guān)鍵作用及表型可逆性。

技術(shù)路線(xiàn)
1. PCSK9 敲除 ESC、PCSK9 R46L 點(diǎn)突變 iPSC
2. 并行培養(yǎng)：

• 神經(jīng)祖細(xì)胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)
• 神經(jīng)類(lèi)器官誘導(dǎo)分化培養(yǎng)

3. 轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序分析
4. 相關(guān)機(jī)制驗(yàn)證分析

研究結(jié)果
通過(guò)對(duì)人腦類(lèi)器官的單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)PCSK9在胚胎發(fā)育前兩個(gè)月內(nèi)高表達(dá)，隨后迅速下降，后期幾乎檢測(cè)不到。該基因主要表達(dá)于頂端放射狀膠質(zhì)細(xì)胞（aRG），在部分中間祖細(xì)胞和深層投射神經(jīng)元中低表達(dá)，而在其他神經(jīng)元中極少表達(dá)，提示PCSK9在早期神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中起關(guān)鍵作用。

為探究其功能，技術(shù)人員構(gòu)建了PCSK9基因敲除的胚胎干細(xì)胞（PCSK9⁻^/⁻ ESC），通過(guò)設(shè)計(jì)靶向第二外顯子的gRNA，實(shí)現(xiàn)了11個(gè)堿基的缺失，導(dǎo)致移碼突變及提前終止密碼子，影響蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域。敲除效果經(jīng)Sanger測(cè)序和Western blot驗(yàn)證。

進(jìn)一步利用神經(jīng)類(lèi)器官（NO）系統(tǒng)比較野生型（WT）與PCSK9⁻^/⁻ ESC的分化過(guò)程。結(jié)果顯示，PCSK9⁻^/⁻ NOs整體形態(tài)較小，神經(jīng)管（NT）結(jié)構(gòu)發(fā)育不完全，周長(zhǎng)和表面積均顯著小于WT NOs。這些結(jié)果表明，PCSK9缺失會(huì)特異性影響神經(jīng)管發(fā)育并導(dǎo)致類(lèi)器官尺寸減小。

圖1 PCSK9缺失導(dǎo)致NOs大小和NT結(jié)構(gòu)改變

(A)不同發(fā)育時(shí)間點(diǎn)的人腦類(lèi)器官中PCSK9表達(dá)和統(tǒng)計(jì)結(jié)果。(B)CRISPR/Cas9介導(dǎo)的PCSK9位點(diǎn)的缺失結(jié)果。(C)WT和PCSK9^-/- ESC中PCSK9的表達(dá)結(jié)果 (D)WT和PCSK9^-/- NO的代表性圖像。(E)NO的直徑、周長(zhǎng)和表面積的量化結(jié)果。^[1]

對(duì)NOs橫截面的免疫熒光染色分析揭示了其內(nèi)部結(jié)構(gòu)特征。通過(guò)SOX2與TBR1共標(biāo)記，可區(qū)分NPCs與成熟神經(jīng)元。NOs在三個(gè)區(qū)域形成類(lèi)神經(jīng)管（NT）結(jié)構(gòu)：腦室區(qū)（VZ，富含NPCs）以及腦室下區(qū)/皮質(zhì)板（SVZ/CP，富含成熟神經(jīng)元）。在野生型（WT）NOs中，NT結(jié)構(gòu)完整，成熟神經(jīng)元（TBR1⁺、CTIP2⁺）均勻分布于NPCs周?chē)�；而PCSK9缺失導(dǎo)致成熟神經(jīng)元減少、NPCs排列紊亂，并阻礙典型環(huán)狀NT結(jié)構(gòu)的形成。神經(jīng)管閉合（NTC）失敗是神經(jīng)管畸形（NTDs）的重要原因，常伴隨細(xì)胞骨架異常。鬼筆環(huán)肽染色顯示，PCSK9⁻^/⁻ NOs中NT區(qū)域細(xì)胞排列混亂，微絲表達(dá)增強(qiáng)，符合NTC障礙特征。

為進(jìn)一步驗(yàn)證PCSK9與NTDs的關(guān)聯(lián)，構(gòu)建了PCSK9 R46L突變體及VANGL2⁻^/⁻ iPSCs來(lái)源的NOs（其中PCSK9^R46L和VANGL2^-/- PSCs由賽業(yè)生物提供）。免疫熒光顯示，兩者均出現(xiàn)成熟神經(jīng)元減少及環(huán)狀NT結(jié)構(gòu)缺失，表型與PCSK9⁻^/⁻類(lèi)似。結(jié)合單細(xì)胞數(shù)據(jù)庫(kù)分析，PCSK9在發(fā)育過(guò)程中主要定位于頂端放射狀膠質(zhì)細(xì)胞（aRG），屬于NPCs亞群。WT NOs中PCSK9確實(shí)富集于SOX2⁺ NPCs區(qū)域，其缺失可能引起NPCs分化異常，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)畸形。為進(jìn)一步探究細(xì)胞表型，將WT與PCSK9⁻^/⁻ ESCs誘導(dǎo)分化為NPCs進(jìn)行培養(yǎng)。WT NPCs呈典型長(zhǎng)梭形，而PCSK9⁻^/⁻ NPCs則表現(xiàn)為多分支、排列雜亂的異常形態(tài)，通常與細(xì)胞骨架紊亂相關(guān)。微絲染色進(jìn)一步證實(shí)，PCSK9⁻^/⁻ NPCs結(jié)構(gòu)混亂、分支增多，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，說(shuō)明PCSK9缺失引起NPCs內(nèi)細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)異常。

圖2 PCSK9缺失導(dǎo)致NPC中的細(xì)胞微絲紊亂

(A)NOs表現(xiàn)出三種不同的NT結(jié)構(gòu)：心室、心室區(qū) (VZ)和心室下區(qū)/皮質(zhì)板SVZ/CP。(B)WT和 PCSK9^-/- NO中成熟神經(jīng)元的免疫熒光染色結(jié)果。正方形表示NT結(jié)構(gòu)，而白色圓形或不規(guī)則形狀表示VZ區(qū)域。(C)異常NTC引起的NTD示意圖。(D)WT和 PCSK9^-/- NO的NT結(jié)構(gòu)中細(xì)胞微絲的免疫熒光染色結(jié)果。(E)熒光染色顯示PCSK9在WT NO的NT結(jié)構(gòu)中的定位和表達(dá)結(jié)果。(F)NPC誘導(dǎo)培養(yǎng)模型圖。(G)WT 和PCSK9^-/- NPC的代表性光學(xué)結(jié)果。(H)WT和PCSK9^-/- NPC中細(xì)胞微絲的免疫染色結(jié)果。[1]

為解析PCSK9缺失引發(fā)NT結(jié)構(gòu)異常的機(jī)制，研究人員進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。共鑒定出3764個(gè)差異表達(dá)基因（DEGs），其中2392個(gè)上調(diào)、1372個(gè)下調(diào)。GO富集分析顯示，這些基因在“神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育”等生物學(xué)過(guò)程，以及“細(xì)胞骨架蛋白結(jié)合”等分子功能和細(xì)胞組分中顯著富集，提示PCSK9缺失主要影響神經(jīng)發(fā)育和細(xì)胞骨架調(diào)控通路，與前期發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞骨架異常導(dǎo)致NTDs相吻合。

進(jìn)一步篩選出140個(gè)與細(xì)胞骨架組裝相關(guān)的關(guān)鍵DEGs，其中肌動(dòng)蛋白調(diào)控因子JMY表達(dá)上調(diào)最為顯著。qPCR驗(yàn)證確認(rèn)其表達(dá)變化具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。JMY已知參與Arp2/3復(fù)合體介導(dǎo)的微絲成核，由此提出假設(shè)：PCSK9缺失通過(guò)上調(diào)JMY，改變Arp2/3復(fù)合體活性，破壞微絲網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而影響細(xì)胞形態(tài)。免疫熒光染色結(jié)果顯示，在WT神經(jīng)類(lèi)器官（NOs）中，JMY正常定位并沿微絲分布；而PCSK9⁻^/⁻ NOs的NT結(jié)構(gòu)閉合不全，JMY在細(xì)胞核與微絲中廣泛高表達(dá)，并在NT結(jié)構(gòu)缺口處異常聚集，伴隨微絲信號(hào)增強(qiáng)。在NPCs層面，PCSK9⁻^/⁻組也呈現(xiàn)JMY高表達(dá)及多分支紊亂形態(tài)。后續(xù)功能回復(fù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，抑制JMY表達(dá)可有效挽救PCSK9缺失引起的表型：在PCSK9⁻^/⁻ NPCs中敲低JMY能改善其多分支形態(tài)；在NOs中敲低JMY則促進(jìn)環(huán)狀NT結(jié)構(gòu)重建，恢復(fù)微絲正常分布，并提高成熟神經(jīng)元標(biāo)志物表達(dá)。綜上，這些結(jié)果表明JMY是PCSK9缺失下游的關(guān)鍵效應(yīng)分子，其失調(diào)通過(guò)破壞細(xì)胞骨架重塑，導(dǎo)致NT結(jié)構(gòu)發(fā)育異常。

圖3 PCSK9通過(guò)JMY調(diào)節(jié)NPC中微絲網(wǎng)絡(luò)的形成來(lái)影響NT結(jié)構(gòu)

(A)GO分析中與生物過(guò)程、分子功能和細(xì)胞成分相關(guān)的項(xiàng)目結(jié)果。(B)細(xì)胞骨架蛋白項(xiàng)目中所有DEG的熱圖。(C)改變基因的qPCR驗(yàn)證的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。(D)細(xì)胞骨架蛋白的分子功能相關(guān)項(xiàng)目。(E,F)JMY和細(xì)胞微絲在NOs(E)和NPCs(F)NT結(jié)構(gòu)上的表達(dá)和共定位的免疫熒光染色結(jié)果。(G)siJMY拯救實(shí)驗(yàn)后WT和PCSK9^-/- NPC中PCSK9和JMY蛋白水平的WB結(jié)果。(H,I)WT和PCSK9-/NPC中細(xì)胞微絲的免疫熒光染色結(jié)果。 (J,K)WT和PCSK9^-/- NT結(jié)構(gòu)中細(xì)胞微絲的免疫熒光染色結(jié)果。[1]

基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選出三個(gè)可能調(diào)控JMY的轉(zhuǎn)錄因子候選，其中HES5顯示出最強(qiáng)的調(diào)控潛力。WB實(shí)驗(yàn)顯示，在PCSK9⁻^/⁻組中HES5與JMY表達(dá)同步上升，提示HES5可能正向調(diào)控JMY。通過(guò)JASPAR數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)HES5在JMY啟動(dòng)子區(qū)存在兩個(gè)潛在結(jié)合位點(diǎn)（#1和#2）。ChIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)HES5在#1位點(diǎn)處顯著富集。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)一步表明，過(guò)表達(dá)HES5可顯著增強(qiáng)JMY啟動(dòng)子活性。為驗(yàn)證“PCSK9缺失通過(guò)HES5上調(diào)JMY”的假說(shuō)，研究人員篩選出高效抑制的HES5 siRNA進(jìn)行挽救實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，抑制HES5可同時(shí)恢復(fù)JMY的表達(dá)水平并改善NPCs的異常形態(tài)。綜上所述，PCSK9缺失通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子HES5正向調(diào)控JMY的表達(dá)，進(jìn)而參與神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中的基因表達(dá)調(diào)控與細(xì)胞形態(tài)維持。

圖4 HES5作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)JMY表達(dá)

(A)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中FOXA3、HES5和ZNF460表達(dá)水平的熱圖。(B)WT和PCSK9^-/- NO中PCSK9、HES5 和JMY蛋白水平的WB結(jié)果。(C)HES5-JMY結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè)。(D)JMY啟動(dòng)子兩個(gè)位點(diǎn)HES5富集的ChIP-qPCR分析結(jié)果。(E)熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證HES5表現(xiàn)出針對(duì)JMY的轉(zhuǎn)錄活性；(F)siHES5拯救實(shí)驗(yàn)后NPC中PCSK9、HES5和JMY蛋白水平的WB結(jié)果。(G)WT和PCSK9^-/- NPC中細(xì)胞微絲的免疫熒光染色結(jié)果。^[1]

既往研究表明，PCSK9可作為分子伴侶，通過(guò)溶酶體途徑促進(jìn)靶蛋白降解。基于此，我們推測(cè)PCSK9可能通過(guò)該途徑調(diào)控HES5水平。為探索其機(jī)制，我們通過(guò)Co-IP聯(lián)合質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)PCSK9與LIN28A存在相互作用，并在PCSK9缺失時(shí)內(nèi)源性L(fǎng)IN28A水平顯著上升。二級(jí)質(zhì)譜及結(jié)構(gòu)對(duì)接模擬進(jìn)一步提示兩者可能直接結(jié)合。在PCSK9⁻^/⁻ NPCs中，溶酶體內(nèi)LIN28A減少，而細(xì)胞質(zhì)及總LIN28A水平升高，提示PCSK9可能促進(jìn)LIN28A的溶酶體降解。為進(jìn)一步驗(yàn)證，我們分別使用CHX抑制蛋白合成和Baf-A1抑制溶酶體活性。結(jié)果顯示，在CHX處理下，PCSK9⁻^/⁻組LIN28A降解減慢；而B(niǎo)af-A1處理后兩組LIN28A水平無(wú)差異，說(shuō)明PCSK9確實(shí)通過(guò)溶酶體途徑調(diào)控LIN28A穩(wěn)定性。免疫熒光顯示PCSK9與LIN28A及溶酶體標(biāo)志物L(fēng)AMP1存在共定位，且PCSK9缺失導(dǎo)致總LIN28A升高。后續(xù)功能回復(fù)實(shí)驗(yàn)表明，抑制LIN28A可改善PCSK9⁻^/⁻ NPCs的多分支形態(tài)，恢復(fù)NOs中微絲表達(dá)并促進(jìn)NT結(jié)構(gòu)環(huán)狀重建，同時(shí)提高成熟神經(jīng)元標(biāo)志物水平。綜上，PCSK9缺失通過(guò)減少LIN28A的溶酶體降解，進(jìn)而上調(diào)HES5與JMY表達(dá)，破壞細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致神經(jīng)管形態(tài)發(fā)生異常。

圖5 PCSK9通過(guò)溶酶體途徑促進(jìn)LIN28A降解來(lái)影響NT結(jié)構(gòu)

(A)PCSK9和LIN28A的Co-IP結(jié)果。(B)CHX處理后NPC的LIN28A蛋白水平的WB結(jié)果。(C)CHX和 Baf-A1處理后NPC的LIN28A蛋白水平的WB結(jié)果。 (D,E)NOs(D)和NPCs(E)NT中PCSK9、LIN28A和 LAMP1的免疫熒光結(jié)果。(F)siLIN28A救援后NPC 中PCSK9、LIN28A、HES5和JMY蛋白水平的WB結(jié)果。(G)siLIN28A救援的NPC中細(xì)胞微絲的免疫熒光染色結(jié)果。(H)抑制劑1632救援的下NT結(jié)構(gòu)中的細(xì)胞微絲的免疫熒光染色結(jié)果。(I)NTD中PCSK9/LIN28A/HES5/JMY調(diào)節(jié)軸介導(dǎo)的細(xì)胞微絲網(wǎng)絡(luò)組裝改變的簡(jiǎn)化示意圖。^[1]

在斑馬魚(yú)和哺乳動(dòng)物中，PCSK9均在外胚層早期發(fā)育及神經(jīng)發(fā)生階段持續(xù)表達(dá)。為探究其功能，他們?cè)O(shè)計(jì)了靶向PCSK9第二外顯子的反義嗎啉寡核苷酸（MO），誘導(dǎo)25-bp缺失以抑制其表達(dá)。結(jié)果顯示，PCSK9-MO純合胚胎在48 hpf時(shí)出現(xiàn)神經(jīng)管（NT）結(jié)構(gòu)異常，RT-PCR證實(shí)其PCSK9轉(zhuǎn)錄水平顯著下降。盡管PCSK9-MO單獨(dú)處理僅引起23%（46/200）的神經(jīng)管畸形（NTDs）發(fā)生率，但進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)JMY mRNA可單獨(dú)誘導(dǎo)NTDs，并與PCSK9-MO產(chǎn)生協(xié)同作用：聯(lián)合處理使NTDs發(fā)生率升高至38%（76/200），并伴隨死亡率上升。組織切片顯示，PCSK9-MO斑馬魚(yú)表現(xiàn)為神經(jīng)管縮短、管腔擴(kuò)張和神經(jīng)絲紊亂，聯(lián)合JMY過(guò)表達(dá)后這些表型進(jìn)一步加劇。行為學(xué)分析表明，PCSK9-MO及JMY過(guò)表達(dá)均導(dǎo)致斑馬魚(yú)運(yùn)動(dòng)能力下降，表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)距離、速度和加速度的顯著降低，而聯(lián)合處理組上述參數(shù)下降更為明顯。綜上，斑馬魚(yú)模型中PCSK9缺失可導(dǎo)致神經(jīng)管發(fā)育異常，而JMY過(guò)表達(dá)不僅單獨(dú)誘發(fā)NTDs，還可協(xié)同增強(qiáng)PCSK9缺失所引起的表型嚴(yán)重程度與發(fā)生率。

圖6 JMY加重了斑馬魚(yú)中PCSK9缺失引起的NTD

(A)針對(duì)斑馬魚(yú)第二外顯子區(qū)域設(shè)計(jì)PCSK9-MO基礎(chǔ)圖。(B)PCSK9-MO、JMY-mRNA及其聯(lián)合給藥對(duì)斑馬魚(yú)NT發(fā)育的影響。(C)PCSK9-MO施用后PCSK9表達(dá)的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果。(D)PCSK9-MO、JMY-mRNA和聯(lián)合治療組中斑馬魚(yú)NTD的發(fā)病率和死亡率百分比。(E)給與JMYmRNA后JMY表達(dá)的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果。(F)PCSK9-MO、JMY-mRNA和聯(lián)合給藥組中斑馬魚(yú)活動(dòng)的熱圖像。(G)PCSK9-MO、JMY-mRNA和聯(lián)合給藥組中斑馬魚(yú)相關(guān)行為的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。[1]

研究結(jié)論
總的來(lái)說(shuō)，這項(xiàng)研究證明，PCSK9的功能性缺失導(dǎo)致神經(jīng)管畸形發(fā)生是通過(guò)LIN28A/HES5/JMY信號(hào)軸導(dǎo)致細(xì)胞微絲網(wǎng)絡(luò)組裝失常的完整信號(hào)通路，為NTD的機(jī)制研究和臨床干預(yù)提供了新靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：
[1]Li X, Wang R, Luo W, et al. PCSK9 Loss-of-Function Disrupts Cellular Microfilament Network via LIN28A/HES5/JMY Axis in Neural Tube Defects. Adv Sci (Weinh). Published online August 11, 2025. doi:10.1002/advs.202504291