RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒操作指南詳細(xì)介紹
實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1. 植物樣品（10-20 mg），研缽，液氮
2. 無水乙醇，β-巰基乙醇
3. 一次性無菌注射器（DNase I 配置），移液器及配套R(shí)Nase-Free無菌槍頭, 離心管
4. 通風(fēng)櫥 渦旋振蕩器 金屬浴 低溫離心機(jī)
實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備-試劑盒準(zhǔn)備1
第一次使用前應(yīng)在漂洗液RW中加入無水乙醇，加入量請(qǐng)參見瓶上標(biāo)簽。并在加入無水乙醇后在瓶身做好標(biāo)記。
DNase I 儲(chǔ)存液的配制
將DNase I 干粉（1500 U）溶解在550 μl RNase-Free ddH2O中，輕柔混勻，分裝后-20℃ 貯存（可保存9個(gè)月）。
注意：從-20℃ 融化后的DNase I儲(chǔ)存液保存于4℃（可保存6周），不要再次凍存。
實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備-試劑盒準(zhǔn)備2
（此步驟建議在通風(fēng)櫥內(nèi)操作）
操作前在SL中加入β-巰基乙醇至終濃度為5%，如475 μl SL中加入25 μl β-巰基乙醇。此裂解液最好現(xiàn)用現(xiàn)配。配好的SL 4℃ 可放置一個(gè)月，裂解液SL在儲(chǔ)存時(shí)可能會(huì)形成沉淀，如果有沉淀出現(xiàn)，請(qǐng)加熱溶解后使用。
操作
Step 1
1、50-100 mg植物葉片在液氮中迅速研磨成粉末
2、加入500 μl SL，立即渦旋混勻（已加入β-巰基乙醇）
Step 2
12,000 rpm(~13,400×g) 離心2 min
Step 3
將上清液轉(zhuǎn)移至過濾柱CS上(過濾柱CS放在收集管中)，12,000 rpm(~13,400×g)離心2 min，小心吸取收集管中的上清至新的RNase-Free的離心管中，吸頭盡量避免接觸收集管中的細(xì)胞碎片沉淀。
Step 4
1、緩慢加入0.4倍上清體積的無水乙醇，顛倒混勻（此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)沉淀），
2、將得到的溶液和沉淀一起轉(zhuǎn)入吸附柱CR3中
3、12,000 rpm(~13,400×g)，離心15-30 sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR3放回收集管中。
Step 5
向吸附柱CR3中加入350 μl 去蛋白液RW1，12,000 rpm(~13,400×g)離心30-60 sec，棄廢液，將吸附柱放回收集管中。
Step 6
DNase I 工作液的配制：
以一個(gè)樣品為例：取10 μl DNase I 儲(chǔ)存液放入新的RNase-free離心管中，加入70 μl RDD溶液，輕柔混勻（用移液槍輕柔吹打混勻）。如同時(shí)提取多個(gè)樣品，建議混合統(tǒng)一配置DNase I 工作液。如樣品較多建議在配置時(shí)預(yù)留出一定的量，以免因移液器的誤差或槍頭吸附造成總量不夠的情況。
Step 7
向吸附柱CR3中央加入80 μl的DNase I 工作液，室溫放置15 min。
Step 8
向吸附柱CR3中加入350 μl 去蛋白液RW1，12,000 rpm(~13,400×g)離心30-60 sec，棄廢液，將吸附柱放回收集管中
Step 9
向吸附柱CR3中加入500 μl漂洗液RW（使用前請(qǐng)先檢查是否已加入乙醇），室溫放置2 min，12,000 rpm(~13,400×g)離心30-60 sec，倒掉廢液，將吸附柱CR3放回收集管中。此步驟去除色素等雜質(zhì)。
Step 10
重復(fù)操作步驟9
Step 11
1、將吸附柱放入新的2 ml收集管中，12,000 rpm(~13,400×g )離心2 min，去除殘余液體。
2、離心后將吸附柱CR3在室溫放置片刻，或置于超凈工作臺(tái)上通風(fēng)片刻，以充分晾干。
注意：漂洗液中乙醇的殘留會(huì)影響后續(xù)的酶反應(yīng)（RT、qPCR等）實(shí)驗(yàn)。但也不要時(shí)間過長(zhǎng)以免過分干燥核酸不易溶解或RNA降解。
Step 12
2、離心后將吸附柱CR3在室溫放置片刻，或置于超凈工作臺(tái)上通風(fēng)片刻，以充分晾干。
注意：漂洗液中乙醇的殘留會(huì)影響后續(xù)的酶反應(yīng)（RT、qPCR等）實(shí)驗(yàn)。但也不要時(shí)間過長(zhǎng)以免過分干燥核酸不易溶解或RNA降解。
Step 12
將吸附柱CR3轉(zhuǎn)入試劑盒自帶的離心管中，加30–50 μl RNase-Free ddH2O，室溫放置2 min，4℃ 12,000 rpm (~13,400×g)離心2 min。
洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于30 μl，體積過小影響回收效率。且RNA應(yīng)保存在-70℃ ，以防降解。
訂購信息
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