高通量螢光素酶報告基因檢測試劑盒的檢測原理、工作流程、優(yōu)勢及應(yīng)用
一、 概述：重新定義報告基因檢測的便捷性與數(shù)據(jù)質(zhì)量
報告基因檢測是研究基因表達(dá)調(diào)控、信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)及藥物篩選的核心實驗技術(shù)。其中，螢火蟲螢光素酶（Firefly Luciferase）因其高靈敏度、寬動態(tài)范圍和易于檢測的特性而被廣泛應(yīng)用。然而，傳統(tǒng)的雙螢光素酶報告基因檢測系統(tǒng)通常需要繁瑣的細(xì)胞裂解步驟，不僅操作耗時、通量受限，還可能因裂解效率不均一引入實驗誤差。
UA-Glo® Bio-luc Luciferase Assay System 是一種基于專有工程化螢光素酶（Bio-luc）的革新性檢測試劑盒。其核心設(shè)計原理是通過對傳統(tǒng)螢火蟲螢光素酶進行定向改造，使其能夠高效地透過細(xì)胞膜，并利用細(xì)胞自身ATP作為能源，在活細(xì)胞或無需裂解的體系中直接催化底物發(fā)光。這一設(shè)計理念，實現(xiàn)了從"終點裂解檢測"到"活細(xì)胞實時或終點均質(zhì)檢測"的范式轉(zhuǎn)變。
二、 系統(tǒng)核心原理與組分
該系統(tǒng)通過優(yōu)化的酶-底物對和檢測緩沖液，實現(xiàn)了對胞內(nèi)螢光素酶活性的直接、定量測量。
核心組分：
工程化螢光素酶（Bio-luc）：該系統(tǒng)并非提供蛋白質(zhì)，而是通過轉(zhuǎn)染質(zhì)粒使細(xì)胞表達(dá)一種經(jīng)過改造的螢光蟲螢光素酶變體。此變體具有增強的胞內(nèi)穩(wěn)定性、催化效率，并優(yōu)化了其與專有底物的反應(yīng)動力學(xué)。
UA-Glo® 檢測試劑：為一種即用型、優(yōu)化的單試劑。該試劑含有經(jīng)過修飾的螢光素（D-luciferin）底物、表面活性劑及反應(yīng)緩沖液。其關(guān)鍵特性在于能夠高效穿透細(xì)胞膜，并維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性，從而支持酶促反應(yīng)在胞內(nèi)進行。
檢測原理：
在表達(dá)Bio-luc螢光素酶的細(xì)胞培養(yǎng)板中，直接加入等體積的UA-Glo® 檢測試劑。試劑迅速混勻并穿透細(xì)胞膜，胞內(nèi)的Bio-luc酶立即利用細(xì)胞自身產(chǎn)生的ATP和滲透進來的底物，催化氧化反應(yīng)產(chǎn)生生物發(fā)光信號。該光信號強度與細(xì)胞內(nèi)活性螢光素酶的量成正比，從而間接反映目標(biāo)基因啟動子的活性或信號通路的強弱。
三、 工作流程與核心應(yīng)用
標(biāo)準(zhǔn)化工作流程：
細(xì)胞處理與培養(yǎng)：將包含感興趣啟動子/反應(yīng)元件與下游Bio-luc報告基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞（如HEK293， HeLa等），在96孔或384孔板中培養(yǎng)并進行實驗處理（如藥物刺激、基因過表達(dá)/敲低）。
平衡與加樣：將培養(yǎng)板在室溫平衡。直接向每孔培養(yǎng)基中加入等體積的UA-Glo® 檢測試劑。
振蕩與孵育：短暫振蕩混勻，室溫孵育10-60分鐘（時間可優(yōu)化），以允許信號充分產(chǎn)生并達(dá)到穩(wěn)定平臺期。
數(shù)據(jù)讀�。菏褂眉嫒莸亩喙δ苊笜�(biāo)儀或化學(xué)發(fā)光檢測儀讀取各孔的發(fā)光值（RLU）。
核心應(yīng)用場景：
基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究：定量分析不同啟動子、增強子或順式作用元件的活性。
信號通路功能驗證：通過構(gòu)建通路特異性反應(yīng)元件驅(qū)動的報告基因，研究GPCR、細(xì)胞因子受體、激酶等信號分子的激活或抑制。
藥物篩選：適用于基于報告基因的高通量藥物篩選（HTS），用于發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)特定通路的小分子化合物、抗體或siRNA。其均質(zhì)化、無需洗滌的"加樣-讀值"模式極大提升了通量和效率。
細(xì)胞表面受體功能分析：與膜受體激活偶聯(lián)的報告基因系統(tǒng)結(jié)合，研究受體配體的相互作用及下游信號。
四、 相比傳統(tǒng)裂解法的技術(shù)優(yōu)勢
操作極簡，通量極高：完全省去裂解、離心、分裝裂解液等步驟，實驗時間從數(shù)小時縮短至數(shù)分鐘，尤其適合大規(guī)模樣品篩選。
數(shù)據(jù)重現(xiàn)性更好：避免了因裂解操作（如裂解時間、振蕩強度）不一致導(dǎo)致的孔間變異，提升了實驗數(shù)據(jù)的精確度和重復(fù)性。
兼容活細(xì)胞與多時間點檢測：由于無需裂解，理論上可在同一批細(xì)胞上進行多個時間點的動力學(xué)監(jiān)測（需優(yōu)化以降低底物消耗和細(xì)胞毒性影響）。
可直接與其他檢測聯(lián)用：在完成發(fā)光檢測后，可根據(jù)需要，使用其他基于培養(yǎng)基的檢測（如細(xì)胞活力CCK-8/MTS）對同一孔細(xì)胞進行后續(xù)分析，實現(xiàn)多重數(shù)據(jù)獲取。
減少廢棄物與交叉污染風(fēng)險：無需開蓋轉(zhuǎn)移裂解液，降低了氣溶膠產(chǎn)生和樣品間交叉污染的可能性。
五、 實驗關(guān)鍵注意事項
細(xì)胞密度與狀態(tài)：信號強度高度依賴于細(xì)胞自身的ATP水平。需確保細(xì)胞處于健康、代謝活躍的狀態(tài)，并優(yōu)化鋪板密度以獲得最佳信噪比。
培養(yǎng)基兼容性：雖然系統(tǒng)對含血清或無雙抗的常見培養(yǎng)基兼容性良好，但某些特殊成分（如高濃度抗氧化劑、影響膜通透性的化合物）可能干擾檢測，建議進行預(yù)實驗驗證。
檢測窗口期：發(fā)光信號通常在加樣后10-30分鐘達(dá)到高峰并穩(wěn)定一段時間。需確定適用于自身實驗體系的最佳讀值時間點。
背景控制：必須設(shè)置未轉(zhuǎn)染報告基因質(zhì)粒的陰性對照孔，以扣除細(xì)胞和培養(yǎng)基自身的本底發(fā)光。
六、 總結(jié)
UA-Glo® Bio-luc Luciferase Assay System 代表了報告基因檢測技術(shù)向更高效、更可靠方向演進的重要一步。它通過巧妙的酶工程與試劑配方設(shè)計，將復(fù)雜的胞內(nèi)酶活性檢測轉(zhuǎn)化為一步完成的均質(zhì)化操作。
其核心價值在于：
解放人力，提升效率：為高通量功能基因組學(xué)和藥物篩選研究提供了理想的工具。
提升數(shù)據(jù)質(zhì)量：通過標(biāo)準(zhǔn)化、自動化的加樣流程，減少了人為操作誤差，增強了結(jié)果的可靠性。
拓展實驗可能性：其非破壞性特點為活細(xì)胞動態(tài)監(jiān)測和多重檢測聯(lián)用提供了新的思路。
對于從事轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號通路研究及藥物早期發(fā)現(xiàn)的科研與工業(yè)界人員而言，該系統(tǒng)是一個能夠顯著優(yōu)化工作流程、加速研究進程的強大工具平臺。
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