抗體芯片在癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移機(jī)制研究中的應(yīng)用
一、研究背景
癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移始于其從原發(fā)灶脫落，進(jìn)而突破內(nèi)皮屏障進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，最終于遠(yuǎn)端器官形成轉(zhuǎn)移灶。接觸抑制缺失是侵襲性腫瘤細(xì)胞的標(biāo)志性特征。有趣的是，常用腫瘤細(xì)胞系的血管侵襲能力受其培養(yǎng)密度調(diào)控：低密度生長的細(xì)胞展現(xiàn)出比高密度細(xì)胞更強的穿越內(nèi)皮單層的能力。此表型在斑馬魚卵黃囊模型中得到驗證，并且具備可逆性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，侵襲性腫瘤細(xì)胞亞群中靶向大腫瘤抑制激酶1（LATS1）的shRNA顯著富集。LATS1是Hippo信號通路的關(guān)鍵組分，其功能是抑制下游效應(yīng)因子YAP的活性。
二、YAP信號通路在密度依賴性腫瘤血管侵襲中的作用研究思路
實驗設(shè)計與樣本制備
為探究細(xì)胞生長密度對血管侵襲性的調(diào)控機(jī)制，本研究以高轉(zhuǎn)移性人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231為模型。實驗設(shè)置如下：將細(xì)胞進(jìn)行低密度培養(yǎng)，以模擬高侵襲性細(xì)胞生長狀態(tài)。在此基礎(chǔ)上，設(shè)立兩組處理：對照組（Vehicle處理）與實驗組（使用特異性YAP抑制劑Verteporfin（VP）進(jìn)行處理）。處理完成后，分別收集兩組細(xì)胞的培養(yǎng)上清液，用于后續(xù)細(xì)胞因子分泌譜的檢測與分析。
預(yù)期結(jié)果與驗證
2.1 證實腫瘤細(xì)胞生長密度對其血管侵襲能力具有調(diào)控作用
通過體外Transwell侵襲實驗及體內(nèi)斑馬魚胚胎轉(zhuǎn)移模型，預(yù)期結(jié)果將驗證前述發(fā)現(xiàn)：低密度培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞相較于高密度培養(yǎng)的細(xì)胞，表現(xiàn)出顯著增強的內(nèi)皮屏障侵襲能力。該部分旨在確立本研究表型觀察的基礎(chǔ)。
三、LATS1-YAP信號軸在密度依賴性血管侵襲中的功能驗證
2.2 LATS1-YAP信號通路是調(diào)控腫瘤細(xì)胞血管侵襲的關(guān)鍵樞紐
為深入解析細(xì)胞密度調(diào)控血管侵襲性的分子機(jī)制，本研究首先通過功能性篩選，鑒定出在高侵襲性腫瘤細(xì)胞亞群中，靶向大腫瘤抑制激酶1（LATS1）的短發(fā)夾RNA（shRNA）顯著富集。LATS1是Hippo信號通路的核心組分，其主要功能在于磷酸化并抑制下游轉(zhuǎn)錄共激活因子YAP的活性。
為明確LATS1在密度依賴性侵襲表型中的具體作用，對MDA-MB-231細(xì)胞進(jìn)行了LATS1基因敲除。實驗結(jié)果顯示，在LATS1缺失條件下，原本侵襲能力較弱的高密度培養(yǎng)細(xì)胞，其侵襲性顯著增強，達(dá)到與低密度細(xì)胞相當(dāng)?shù)乃�；而低密度�?xì)胞的侵襲能力未受進(jìn)一步影響。此結(jié)果表明，LATS1的缺失足以解除高密度生長對細(xì)胞侵襲的抑制，是介導(dǎo)密度表型差異的關(guān)鍵因子。
在此基礎(chǔ)上，為確認(rèn)其下游效應(yīng)分子YAP的功能，在體內(nèi)及體外模型中應(yīng)用了YAP特異性抑制劑。實驗發(fā)現(xiàn)，抑制YAP活性后，低密度腫瘤細(xì)胞原本增強的血管侵襲能力被顯著削弱。以上遺傳學(xué)與藥理學(xué)證據(jù)共同證實，Hippo通路中的LATS1-YAP信號軸是調(diào)控腫瘤細(xì)胞密度依賴性血管侵襲行為的核心分子通路。
四、基于蛋白質(zhì)芯片篩選YAP下游介導(dǎo)血管侵襲的關(guān)鍵細(xì)胞因子
2.3 鑒定YAP調(diào)控的分泌因子及其在血管侵襲中的功能
為系統(tǒng)探究YAP活性如何影響腫瘤細(xì)胞的分泌譜，進(jìn)而調(diào)控血管侵襲行為，本研究采用抗體芯片技術(shù)對細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行無偏倚篩選。分別收集低密度培養(yǎng)的MDA-MB-231細(xì)胞經(jīng)Vehicle（對照組）或YAP抑制劑Verteporfin（VP，實驗組）處理后的上清液進(jìn)行檢測。
芯片分析結(jié)果顯示，與對照組相比，VP處理組細(xì)胞上清中多種細(xì)胞因子的分泌水平顯著下調(diào)，其中包括IL-1α、IL-1β、IL-8以及CXCL1、CXCL2、CXCL3等。
在功能層面，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，低密度腫瘤細(xì)胞的條件培養(yǎng)基能夠顯著抑制內(nèi)皮細(xì)胞單層的劃痕修復(fù)能力，而高密度細(xì)胞的條件培養(yǎng)基則無此效應(yīng)。此外，使用特異性中和抗體封閉CXCR2（上述部分CXCL因子的共同受體），可有效抑制低密度腫瘤細(xì)胞的血管侵襲能力。
上述結(jié)果共同表明，低密度腫瘤細(xì)胞通過YAP依賴的方式上調(diào)特定細(xì)胞因子組的分泌，這些因子以自分泌及旁分泌模式作用于腫瘤細(xì)胞自身及周圍微環(huán)境（如內(nèi)皮細(xì)胞），協(xié)同促進(jìn)血管侵襲過程。
五、LATS1-YAP信號通路介導(dǎo)密度依賴性血管侵襲的機(jī)制整合
綜合上述實驗結(jié)果，本研究闡明了一條清晰的調(diào)控通路：腫瘤細(xì)胞生長密度的變化，通過調(diào)節(jié)Hippo信號通路核心激酶LATS1的活性，影響其下游效應(yīng)因子YAP的轉(zhuǎn)錄共激活功能。YAP活性的改變進(jìn)一步調(diào)控了包括IL-8、CXCL1/2/3等在內(nèi)的特定細(xì)胞因子組的表達(dá)與分泌。這些因子通過自分泌作用于腫瘤細(xì)胞自身，并通過旁分泌作用于微環(huán)境中的內(nèi)皮細(xì)胞，共同構(gòu)成一個促侵襲微環(huán)境，最終決定性地影響了腫瘤細(xì)胞的血管侵襲能力。該機(jī)制整合示意圖如下所示。
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| 貨號 | Panel名稱 | 種屬 | 檢測指標(biāo) |
| LXAH015-1 | 人多能干細(xì)胞抗體芯片Panel(15因子) | Human | Sox2,E-Cadherin,hCG-α,Oct-3/4,Nanog,Alpha-Fetoprotein (AFP),GATA-4,HNF-3 beta/FoxA2,PDX-1/IPF1,SOX17,Otx2,TP63/TP73L,Goosecoid (Gsc),Snail,VEGF R2/KDR/Flk-1 |
| LXAH026-1 | 人細(xì)胞應(yīng)激抗體芯片Panel(26因子) | Human | DKK-4,Bcl-2,Cytochrome C,HSP60,HSP70,IDO/IDO1,ADAMTS1,HIF-2 alpha,Phospho-p38 alpha (T180/Y182),Phospho-HSP27 (S78/S82),Phospho-p53 (S46),Carbonic Anhydrase IX,PON1,Cited-2,PON2,COX-2,PON3,Phospho-JNK Pan (T183/Y185),Thioredoxin-1,NFkappaB1,SIRT2,FABP1/L-FABP,p21/CIP1,SOD2,HIF-1 alpha,p27/Kip1 |
| LXAM025-1 | 小鼠趨化因子抗體芯片Panel(25因子) | Mouse | CCL11/Eotaxin,IL-16,CXCL10/IP-10/CRG-2,CXCL11/I-TAC,CCL2/JE/MCP-1,CCL12/MCP-5,CCL22/MDC,CCL27/CTACK,CX3CL1/Fractalkine,LIX,CCL5/RANTES,CCL8/MCP-2,CXCL13/BLC/BCA-1,CXCL16,CCL28,Chemerin,CCL21/6Ckine,CXCL9/MIG,CCL6/C10,CXCL12/SDF-1,CCL9/10/MIP-1 gamma,Complement Component C5/C5a,CXCL2/MIP-2,CXCL1/KC,CCL3/CCL4 (MIP-1 alpha /MIP-1 beta) |
| LXAM021-1 | 小鼠細(xì)胞凋亡抗體芯片Panel(21因子) | Mouse | Mcl-1,BAD (Total),HIF-1α,p53,TNFRI/TNFRSF1A,Bcl-2,Cytochrome C,CD95/Fas/TNFRSF6/APO,HSP27,HSP60,TRAIL R2/TNFRSF10B,p27/Kip1,Bcl-x,HO-1/HMOX1/HSP32,Cleaved Caspase-3,HO-2/HMOX2,SMAC/Diablo,Catalase,Claspin,HSP70/HSPA1A,XIAP |
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