mRNA技術(shù)在新冠疫苗中的成功應(yīng)用，推動(dòng)了其在癌癥免疫治療、遺傳病修復(fù)等領(lǐng)域的廣泛研究。然而，由于血腦屏障（BBB）的存在，mRNA藥物難以有效遞送至腦組織，限制了其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療中的應(yīng)用。傳統(tǒng)的遞送方式如顱內(nèi)注射存在創(chuàng)傷大、難以廣泛覆蓋腦區(qū)的問(wèn)題，而系統(tǒng)性給藥的脂質(zhì)納米顆粒（LNP）則多靶向肝臟，無(wú)法有效穿透BBB。

因此，開(kāi)發(fā)一種安全高效、可規(guī)�；�生產(chǎn)的腦靶向mRNA遞送系統(tǒng)成為當(dāng)前科研攻關(guān)的焦點(diǎn)。近日，董一洲院士團(tuán)隊(duì)在Science Advances上發(fā)表題為“Lipid nanoparticles for mRNA delivery in brain via systemic administration”的研究，報(bào)道了一種新型腦靶向LNP用于腦膠質(zhì)瘤的治療。

文中LNP使用了邁安納(上海)儀器科技有限公司的納米藥物制備系統(tǒng)進(jìn)行制備。

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01 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
新型可離子化脂質(zhì)的篩選與優(yōu)化
SLNPs的合成與表征：本研究成功設(shè)計(jì)并合成了一系列基于SR-57227的離子化脂質(zhì)（SLs），其結(jié)構(gòu)包含SR-57227頭部、氨基連接鍵和可生物降解的脂質(zhì)尾部（圖1A）。通過(guò)核磁共振氫譜和質(zhì)譜驗(yàn)證了合成的SLs的結(jié)構(gòu)準(zhǔn)確性。進(jìn)一步，將SLs與膽固醇（Chol）、二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE）、1,2-二肉豆蔻�；�-sn-甘油-甲氧基聚乙二醇-2000（DMG-PEG2k）和熒光素酶（FLuc）mRNA混合，制備成SLNPs。動(dòng)態(tài)光散射儀測(cè)定結(jié)果顯示，SLNPs的粒徑范圍在120至180納米之間，PDI均低于0.3，表明SLNPs具有良好的分散性。

體外mRNA遞送效率評(píng)估：通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，評(píng)估了不同SLNPs在N2a神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系、原代星形膠質(zhì)細(xì)胞和bEnd.3腦內(nèi)皮細(xì)胞系中的mRNA遞送效率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，S0、S4和S6 LNPs在所有測(cè)試的細(xì)胞類(lèi)型中均展現(xiàn)出最高的熒光素酶活性（圖1B）。基于這些結(jié)果，選擇S4 LNP進(jìn)行進(jìn)一步的體內(nèi)驗(yàn)證。

Fig. 1. Construction of SLNPs for brain delivery.

體內(nèi)mRNA遞送效率優(yōu)化：通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了S4 LNP的脂質(zhì)成分比例，篩選出最優(yōu)配方OS4 LNP（圖2A-C）。

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，靜脈注射FLuc OS4 LNP后，腦組織中的熒光素酶活性顯著高于MC3、SM-102和ALC-0315 LNPs，分別提高了約13.3倍、12.5倍、9.6倍和2倍（圖2D, E）。這些結(jié)果表明，OS4 LNP在穿透BBB和遞送mRNA至腦組織方面具有顯著優(yōu)勢(shì)。

Fig. 2. Optimization and evaluation of S4 LNP for brain delivery.

細(xì)胞穿透肽修飾增強(qiáng)腦遞送效率
CPPs修飾對(duì)LNP性質(zhì)的影響：為了進(jìn)一步提高OS4 LNP的腦遞送效率，本研究通過(guò)點(diǎn)擊化學(xué)將10種不同的細(xì)胞穿透肽（CPPs）修飾到OS4 LNP表面。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，A5K、THR和LAH4肽修飾導(dǎo)致OS4 LNP發(fā)生聚集，粒徑超過(guò)450納米（圖3B），因此排除了這些肽的進(jìn)一步研究。

在剩余的7種CPPs中，pVEC、RVG和Tat肽修飾顯著提高了OS4 LNP的腦遞送效率，其中Tat肽修飾的OS4T LNP展現(xiàn)出最高的遞送效率，比未修飾的OS4 LNP提高了約12.7倍（圖3C）。

BBB穿透機(jī)制研究：通過(guò)Transwell遷移實(shí)驗(yàn)，研究了OS4和OS4T LNP穿透BBB的機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，OS4 LNP的穿透作用主要通過(guò)巨胞飲作用和穴樣內(nèi)陷途徑介導(dǎo)，而OS4T LNP則利用多種途徑穿透BBB。

Fig. 3. The mRNA delivery efficiency and safety of CPP-conjugated OS4 LNPs.

不同腦細(xì)胞類(lèi)型中的mRNA遞送效率
GFP mRNA遞送效率：通過(guò)靜脈注射GFP mRNA負(fù)載的OS4T LNP至C57BL/6J小鼠體內(nèi)，12小時(shí)后通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析不同腦細(xì)胞類(lèi)型中的GFP表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與MC3 LNP相比，OS4 LNP顯著提高了神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞（BCECs）中的GFP表達(dá)（圖4A）。Tat修飾進(jìn)一步增強(qiáng)了OS4T LNP在這些細(xì)胞類(lèi)型中的遞送效率（圖4A）。

Cre mRNA遞送效率：在Ai14小鼠模型中，通過(guò)靜脈注射Cre mRNA負(fù)載的OS4T LNP，7天后通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光成像分析tdTomato表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，單次注射OS4T LNP后，神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和BCECs中的tdTomato陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著高于MC3 LNP組（圖4B）。此外，三次注射OS4T LNP進(jìn)一步提高了這些細(xì)胞類(lèi)型中的基因編輯效率（圖4B）。免疫熒光成像結(jié)果也證實(shí)了OS4T LNP在腦組織中的廣泛遞送（圖4D-G）。

Fig. 4. OST4 LNP enables effective mRNA delivery into different brain cells.

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤治療
eIL-12 mRNA的設(shè)計(jì)與驗(yàn)證：為了降低IL-12的系統(tǒng)性毒性，本研究設(shè)計(jì)了一種工程化IL-12（eIL-12）mRNA，其通過(guò)MMP9敏感的連接子與IL-12受體β1鏈融合（圖5A）。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，eIL-12能夠在MMP9存在的情況下被切割，釋放出具有生物活性的IL-12（圖5B）。此外，與野生型IL-12 mRNA相比，eIL-12 mRNA在健康C3H/HeJ小鼠中表現(xiàn)出更好的耐受性（圖5C）。

抗腫瘤治療效果：在正位膠質(zhì)母細(xì)胞瘤小鼠模型中，通過(guò)靜脈注射OS4T LNP包裹的eIL-12 mRNA，評(píng)估其對(duì)腫瘤生長(zhǎng)和生存期的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，OS4T-eIL-12 LNP治療顯著抑制了腫瘤生長(zhǎng)（圖5E），并延長(zhǎng)了小鼠的生存期（圖5F）。治療組小鼠的中位生存期延長(zhǎng)至37天，是對(duì)照組（17天）的兩倍以上。此外，治療未引起顯著的體重下降和其他副作用，表明OS4T-eIL-12 LNP具有良好的安全性和有效性。

免疫反應(yīng)分析：通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和細(xì)胞因子檢測(cè)，分析了OS4T-eIL-12 LNP治療后的免疫反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，治療顯著上調(diào)了腦組織中M1型巨噬細(xì)胞和 microglia 的標(biāo)記物（CD80、CD86和iNOS）的表達(dá)，并減少了調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例。同時(shí)，治療還激活了CD8+ T細(xì)胞，表現(xiàn)為T(mén)NF-α+和CD69+ CD8+ T細(xì)胞比例的增加。此外，治療組腦組織中的IFN-γ水平顯著高于對(duì)照組，進(jìn)一步證實(shí)了eIL-12的免疫激活作用。

Fig. 5. Therapeutic efficacy of OS4T LNPs in an orthotopic mouse model of GBM.

02 小結(jié)
本研究通過(guò)設(shè)計(jì)新型可離子化脂質(zhì)并結(jié)合細(xì)胞穿透肽修飾，成功開(kāi)發(fā)了一種能夠高效穿透BBB的LNP系統(tǒng)（OS4T LNP）。該系統(tǒng)通過(guò)全身給藥途徑實(shí)現(xiàn)了mRNA在腦組織中的高效遞送，并在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤小鼠模型中展現(xiàn)出顯著的治療效果。OS4T LNP的成功開(kāi)發(fā)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供了新的策略，并有望推動(dòng)mRNA藥物在腦部疾病中的臨床應(yīng)用。

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參考文獻(xiàn)：Lipid nanoparticles for mRNA delivery in brain via systemic administration.